BONNES PRATIQUES
PURIFICATION DES PLASMIDES
COMMENT AMÉLIORER LE RENDEMENT DES PLASMIDES ?
Bonnes pratiques pour purifier des plasmides avec un rendement optimal
Les conditions de culture bactérienne, l'efficacité de lyse des cellules et de neutralisation sont des facteurs majeurs qui impactent le rendement des plasmides.
QUELLES SONT LES BONNES PRATIQUES POUR LA CULTURE D’E. COLI ?
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Pour obtenir un bon rendement de plasmide, il faut s’assurer que le plasmide d’intérêt est bien propagé dans les cellules d’E. coli. Pour cela, il faut utiliser le bon antibiotique permettant la sélection du plasmide. Et il faut veiller à ce que les conditions de culture soient optimales.  Voici les bonnes pratiques à suivre et celles à éviter pour que la culture bactérienne soit optimales

Bonnes Pratiques à suivre :  
.   Utiliser une colonie fraîche bien isolée pour ensemencer la pré-culture.
.   Vérifier que la concentration d’antibiotique est optimale pour une sélection efficace des cellules contenant le plasmide d’intérêt. Retrouver les concentrations
    optimales d’antibiotique dans la Q/R suivante.
.   Agiter rigoureusement la culture pour garantir une aération optimale.
  Généralement la vitesse d’agitation optimale est entre 250 rpm à 300 rpm.
.   Arrêter la culture à la fin de la phase de croissance logarithmique et avant la phase stationnaire.
   Cela correspond à une durée de culture de 12h à 16h ou à une D.O. à 600 nm de 0,2 à 0,35 quand la culture est diluée au 1:10.
.   Respecter la température de culture (ex. 37°C, 30 °C …) en fonction de la souche d’E. coli

Ce qu’il faut éviter :
.   Ensemencer une culture à partir d’un stock de glycérol ou d’une colonie sur une boîte de Petrie ayant plus d’un mois.
    Car il peut y avoir la perte du plasmide et/ou des mutations dans le plasmide.
  Arrêter la culture en phase de croissance logarithmique ou phase stationnaire.
   Car le nombre maximal de copies de plasmide est atteint à la fin de la phase de croissance logarithmique et les ADN sont dégradés pendant la phase
   stationnaire.
QUELLE EST LA CONCENTRATION OPTIMALE D’ANTIBIOTIQUE ?
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La concentration optimale de l’antibiotique est celle qui permet la propagation du plasmide et la bonne croissance des cellules d’E. coli.
Ci-dessous un tableau récapitulatif des concentrations optimales d’antibiotiques habituellement utilisés pour la sélection des plasmides chez E. coli.
Concentration optimale d'antibiotiques pour sélectionner les plasmides
A noter que l’ampicilline peut être dégradée rapidement dans le milieu de culture. Il est possible d’augmenter la concentration de l’ampicilline si nécessaire. Il est important d’utiliser des colonies et des cultures les plus fraîches possibles. L’antibiotique Carbenicilline qui est plus stable peut être utilisé à la place de l’ampicilline.

Certains antibiotiques sont sensibles à la chaleur. Laisser refroidir le milieu en dessous de 55°C avant de les ajouter. D’autres antibiotiques peuvent être sensibles à la lumière, ex. la tétracycline. Conserver les solutions et les cultures contenant ces antibiotiques à l’abris de la lumière. Des souches d’E. coli peuvent avoir des résistances naturelles à certains antibiotiques. Vérifier la compatibilité de la souche avec l’antibiotique choisi.
QUEL EST LE MILIEU DE CULTURE RECOMMANDÉ, LB OU TB ?
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Nous conseillons le milieu LB qui est moins riche que le milieu TB. Cela permet d’éviter qu’une culture d’E. coli soit saturée trop rapidement. La masse de cellules obtenue avec le milieu LB est également plus optimale. Si vous devez travailler en milieu TB, diminuer la durée de culture et diminuer le volume de culture pour la préparation des plasmides.
COMMENT OPTIMISER L’EFFICACITÉ DE LA LYSE CELLULAIRE ET DE LA NEUTRALISATION ?
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La lyse et la neutralisation influencent tous les deux le rendement des plasmides. En effet, lorsque la lyse des cellules est incomplète, les colonnes de purification sont souvent bouchées, et lorsque la neutralisation est incomplète, la fixation de plasmide à la matrice est affectée. Il y a plusieurs astuces à suivre pour rendre la lyse et la neutralisation complètes :
Utiliser une culture fraîche. Il est conseillé de congeler les culots de cellules à -70°C si la purification de plasmide ne peut pas se faire immédiatement.
Ne travailler pas avec une culture en saturation. Car il y a trop de cellules dans ce cas et la lyse est souvent incomplète
Utiliser des tampons P1, P2 et P3 colorés dont le changement de couleur permet de contrôler les efficacités de lyse et de neutralisation. Les kits ZymoPURE™ II Plasmide proposent ces types de tampons colorés.
Les kits ZymoPURE™  permettent de contrôler la lyse et la neutralsiation grâce aux changements de couleur
EST-CE QUE LA SOUCHE D’E. COLI PEUT INFLUENCER LE RENDEMENT ?
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Oui. La plupart des souches d’E. coli sont adaptées aux propagations de plasmides. Les souches endA- permettent d’obtenir de meilleur rendement, car le gène endA, codant pour une nucléase co-purifiée avec les plasmides, est inactivé par mutation.
QUELS SONT LES CONSEILS POUR AUGMENTER LE RENDEMENT DES PLASMIDES AYANT UN FAIBLE NOMBRE DE COPIES ?
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On pense à tort qu’il suffit d’augmenter le volume de culture, mais malheureusement cela n’augmente pas systématiquement le rendement. Il est nécessaire d’optimiser les conditions et volumes de culture ainsi que les tampons …

Zymo Research a optimisé un protocole pour la préparation de plasmides à faible nombre de copies avec le ZymoPURE™ II Plasmid Maxiprep kit