BONNES PRATIQUES
Tout ce que vous n'avez jamais osé demander pour réussir vos clonages


Obtention des fragments d'ADN par PCR - PCR haute-fidélité
La PCR permet d'amplifier des fragments d'ADN n'importe où dans une matrice d'ADN même si la quantité de matériel de départ est faible. La PCR haute-fidélité qui garantit la fidélité des séquences d'ADN amplifiées est devenue une méthode courante pour obtenir des inserts ou des vecteurs pour le clonage.
RAPPELS SUR LA PCR HAUTE-FIDÉLITÉ
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Comment définit-on la fidélité d'une ADN polymérase ?
La fidélité de la PCR est exprimée très souvent en taux d’erreur (ou taux de mutation) qui correspond à la fréquence de mutation (nucléotide(s) incorporé(s) erreur) par pair de base incorporée et par duplication. Toutes les ADN polymérases peuvent incorporer des nucléotides inappropriés au cours d’une duplication, certaines peuvent les reconnaître, les enlever et les remplacer par les nucléotides corrects grâce à l’activité 3’ – 5’ exonucléase, également appelée l'activité de relecture (« proofeading »). La Taq ADN polymérase, n’ayant pas d’activité de relecture intrinsèque, introduit environ une erreur tous les 1 à 2 kilobases (kb). Les enzymes de PCR fidèle ont toutes une activité de relecture.
Les ADN Polymérases thermostables fidèles

Les ADN polymérases fidèles seules :
Ces polymérases possèdent toutes une activité exonucléasique 3’-5’ intrinsèque. Elles sont environ 6 à 7 fois plus fidèles qu’une Taq ADN polymérase. L’une des premières polymérases fidèles découvertes utilisées provient du Pyroccus furiosus (Ex : Pfu ADN polymérase). Généralement, ces polymérases ne peuvent pas amplifier des fragments d’ADN au delà de 2 kb.

La « Technologie LA » ou les mélanges d’enzymes :
La « technologie LA » (« Long & Accurate ») est une technologie brevetée qui consiste à mélanger une Taq ADN polymérase avec, en faible quantité, une ADN polymérase thermostable ayant une activité de relecture. L’activité de relecture de la deuxième enzyme confère la fidélité au mélange. La fidélité des mélanges d’enzyme est d'environs 6 à 10 fois supérieure à la Taq.

Les enzymes de PCR haute-fidélité de fusion :
Des ADN polymérases thermostables avec une activité de relecture accrue ont été découvertes et sélectionnées au cours des dernières décennies (par exemple les ADN polymérases « Pyroccocus like »). Fusionnées à un ou plusieurs cofacteurs telle qu'une protéine de fixation à l’ADN non spécifique d’une séquence (par exemple la Sso7d extrait du Sulfolobus solfataricu), elles sont au moins 50 fois plus fidèle qu'une Taq.  De plus elles sont très processives dont la vitesse d’élongation et le rendement sont nettement supérieurs à une Taq. Par exemple, une ADN polymérase de fusion peut amplifier à une vitesse entre 5 sec à 15 sec/kb. La Fidelio® Hot Stat DNA Polymerase appartient à ces enzymes.
Histogramme taux d'erreur des enzymes de PCR haute fidélité
BONNES PRATIQUES
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Comment choisir son ADN polymérase haute-fidélité afin qu'elle soit adaptée ?
  • Au fragment d'ADN à amplifier :
Il est nécessaire de prendre en compte la longueur et la complexité des séquences d'ADN à amplifier. Nous recommandons également d'utiliser une ADN polymérase à démarrage à chaud ("hot start") pour garantir la spécificité de l'amplification essentielle pour le clonage.

  • A ma méthode de clonage :
L’amplification du fragment d’ADN par une enzyme haute-fidélité rend ce fragment compatible avec la grande majorité des méthodes de clonage  comme par restriction enzymatique/ligation, clonage TA, fusion de brins (Gibson), etc…

  • le clonage via le "TA-cloning" : vous devez utiliser une ADN polymérase fidèle produisant des extrémités A-sortantes. Si toutefois l'enzyme que vous utilisez produit des extrémités franches, il est possible de les convertir en extrémités A-sortantes. Retrouvez le protocole dans les FAQ.
  • les clonages via restriction/ligation ou l'assemblage comme la méthode de "Gibson" : n’importe quelle ADN polymérase haute-fidélité peut être utilisée.
Est-ce que je dois dessiner les amorces spéciales pour la PCR en vue du clonage ?
Les primers sont conçus de façon à être complémentaires de la cible à amplifier. Hormis pour le clonage TA, des bases supplémentaires sont en général ajoutées en 5’ des amorces comme un site de restriction, ou des bases holologues au vecteur dans le cas de la technique de clonage par fusion de brins "Gibson". dans ce dernier cas, il est nécessaire d’ajouter 30 à 40 bases en 3’ des oligos forward et reverse. Ces bases seront complémentaires des extrémités du vecteur linéarisé (voir plus d’infos à venir dans les bonnes pratiques sur les kits de clonage)
Y-a-t-il besoin d'un protocole de PCR spécial pour le clonage ?
Non, vous devez suivre le protocole recommandé pour l'ADN polymérase haute-fidélité choisie. Si vous utilisez des amorces constituées de séquences spécifiques de la PCR et de séquences spéciales pour le clonage, ce sont les Tm des amorces spécifiques de la PCR qui doivent être pris en compte pour calculer les températures d'hybridation optimales.
FAQ - QUESTIONS FRÉQUEMMENT POSÉES
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Quelle enzyme PCR haute-fidélité utiliser pour amplifier des fragments de 20 kb ?
La Fidelio® Hot Start DNA Polymerase permet d'amplifier jusqu’à 23 kb d’ADN génomique humain.
Amplification d'ADN génomique jusqu'à 23 kb avec la Fidelio
Quelle enzyme haute-fidélité utiliser pour amplifier une matrice riche en GC ?
La Fidelio® Hot Start DNA Polymerase permet d'amplifier des matrices hautement riche en GC; par exemple elle est performante à partir d’ADN génomique humain jusqu’à 78% de GC. Un format est disponible  avec un tampon optimisé pour les séquences riches en GC.
Amplification de séquences GC-rich avec la Fidelio
Quelle enzyme PCR haute-fidélité utiliser pour amplifier des fragments d'ADN génomique de différentes espèces ?
La Fidelio® Hot Start DNA Polymerase a permis d'amplifier avec succès des ADN génomiques issus de différentes epèces ; humain, souris, plante, etc...
Amplification d'ADN de différentes espèces avec la Fidelio
Est-ce que les fragments d’ADN amplifiés par des enzymes de PCR fidèle sont compatibles avec le « TA Cloning » ?
Tout dépend de l’enzyme fidèle utilisée :
  • Si c’est une enzyme Haute Fidélité seule ou fusionnée : les produits d’amplifications générés ne sont pas compatibles avec le clonage TA, car ils ont tous des extrémités franches dépourvues de A sortants, rendant ce type de clonage impossible. Il est nécessaire dans ce cas de traiter le fragment de PCR
  • En revanche, les ADN amplifiés par un mélange d’enzyme (Taq DNA polymérase associée à une enzyme avec une activité exonucléasique 3’-5’) peuvent être clonés par les systèmes « TA Cloning ». Car une partie des ADN amplifiés contient des extrémités franches et une autre des extrémités A-sortantes. Dans ce cas, il est recommandé de réaliser le clonage TA immédiatement après la PCR.
Cependant l’option recommandée pour réaliser un clonage TA est d’utiliser une enzyme PCR hautement fidèle générant des bouts francs, puis de traiter le fragment obtenu pour ajouter des A sortants.

Comment ajouter des A aux fragments d’ADN amplifiés par PCR dont les extrémités sont franches pour ensuite les cloner par le « TA Cloning » ?
Vous devez d’abord éliminer complètement l’enzyme Haute Fidélité (à l’aide d’un kit de purification d’ADN de PCR ou en réalisant une extraction par phénol/chloroforme suivie d’une précipitation à l’éthanol) puis ajouter de la Taq DNA Polymérase. Exemple de protocole ci-dessous :
  • Produit de PCR purifié
  • dATP : 0,2 mM
  • Tampon de réaction de la Taq : 1x
  • Taq DNA Polymerase : 1 unité
Incubation à 72°C pendant 20 min.



EN SAVOIR PLUS SUR LA PCR HAUTE-FIDÉLITÉ ? Lire le TechOzyme dédié