BONNES PRATIQUES
Tout ce que vous n'avez jamais osé demander pour réussir vos clonages


Purification des fragments d'ADN après la PCR
Dans ce deuxième volet, nous publions nos conseils sur la manière d'obtenir de l'ADN ultra pur sans contaminations croisées de sels ou de solvants et prêt en quelques minutes pour le clonage.
Pourquoi l'ADN amplifié par PCR doit être purifié avant le clonage ?
C'est à cause des amorces, des nucléotides non incorporés pendant  la PCR ainsi que l'enzyme de PCR, les sels et le tampon de réaction de PCR. Tous ces éléments peuvent impacter l'efficacité du clonage et doivent être préalablement éliminés.
Quelles sont les techniques de purification de produits de PCR ?
Plusieurs méthodes sont disponibles :
  • la méthode au phénol/chloroforme suivie par la précipitation à l'éthanol.
  • la purification sur des colonnes de micro-centrifugation équipées de membrane de silice.
  • la purification sur des billes magnétiques.
  • le nettoyage enzymatique (ex. nucléases, phosphatases...)
Toutes ces techniques présentent des avantages et des inconvénients. Par exemple :
  • la méthode au phénol/chloroforme est longue et toxique.
  • la purification sur des colonnes ou des billes magnétiques est plus simple et rapide mais les rendements sont plus ou moins élevés et ne sont jamais à 100%.
  • même si la technique de nettoyage enzymatique est ultra-simple, rapide et garantit des rendements d'ADN à 100%, sa compatibilité avec les méthodes de clonage doit être validée au préalable.
En savoir plus sur les principes et les méthodes de purification des acides nucléiques, lire le TechOzyme dédié.
Comment choisir la technique de purification ?
Cela dépend essentiellement du nombre de clonage et donc du nombre de fragments d'ADN à purifier.
  • la purification au phénol/chloroforme suivie d'une précipitation à l'éthanol est longue mais très peu onéreuse. Elle est idéale pour réaliser un ou deux clonages.
  • pour les clonages de routine, la purification sur des colonnes ou des billes magnétiques est à privilégier. De plus ces deux techniques sont disponibles en versions haut-débit ou automatisables.
  • le nettoyage enzymatique est une option très intéressante pour les clonages de routine à haut-débit. Elle est également automatisable. Une fois validée pour la technique de clonage, c'est la méthode la plus simple et efficace.
Pourquoi recommandons-nous les colonnes Zymo-Spin™ ?
La purification sur des colonnes de micro-centrifugation ("Spin-colunm") équipées de membrane de silice est à la fois simple, rapide et universelle. En effet elle est compatible avec tout type de clonage. Le rendement et la pureté de l'ADN sont généralement très satisfaisants. C'est la technique plébiscitée par un grand nombre de laboratoires. Mais les colonnes traditionnelles ne permettent pas d'éliminer complètement les traces de tampons, de sels ou de solvant. La pureté des ADN est souvent compromise.
Les colonnes Zymo-Spin™ bénéficiant de la technologie Zymo-Spin™ ont été spécialement conçues pour garantir l'élimination totale des contaminants. Les ADN élués sont ultra purs, exempts de sels, de solvants ou de tampons. De plus, les colonnes Zymo-Spin™ permettent de concentrer en parallèle les ADN grâce à des volumes d'élution pouvant descendre jusqu'à 6 µl.
Faut-il purifier les produits de PCR sur un gel d'agarose ?
Cela dépend de la spécificité d'amplification par PCR.
  • Non, si un seul fragment d'ADN spécifique est amplifié. Nous recommandons le DNA Clean & Concentrator™ Kit pour purifier le fragment d'ADN. Car ce kit inclut des colonnes Zymo-Spin™. Vous obtiendrez en quelques minutes de l'ADN ultra pur et concentré.
  • Oui, si l'amplification n'est pas spécifique et les produits de PCR contiennent à la fois les fragments d'ADN spécifique(s) et non spécifique(s). Vous devez isoler le fragment spécifique sur un gel d'agarose puis le purifier.
Pour cela, nous conseillons les produits suivants :
Ces deux kits incluent des colonnes Zymo-Spin™.

  • Le FlashGel™ DNA Recovery Kit (ADN 10 pb - 4 kb) : permet de purifier directement  le fragment d'ADN sur un gel d'agarose en moins de 10 minutes. Il n'y a ni besoin d'exciser la bande d'agarose incluant le fragment d'ADN à purifier sous les lumières UV ou de purifier l'ADN sur des colonnes. De plus les ADN ne seront pas endommagés par les UV. C'est une méthode ultra-rapide avec des rendements > 80% idéale pour des projets de clonage à haut débit. Ce kit doit être utilisé avec le système FlashGel™.
Nos astuces pour augmenter la pureté et le rendement des acides nucléiques.
  1. La purification sur des colonnes de micro-centrifugation :
  • Centrifuger la colonne à la vitesse maximale.
  • Utiliser les tampons de lavage pour rincer la paroi interne de la colonne au moment de les déposer sur la colonne.
  • Réaliser une centrifugation supplémentaire avant l’étape d’élution.
  • Bien vérifier qu'aucune goutte n'est à la sortie de la colonne avant de la transférer dans le tube d’élution.
  • Déposer le tampon d'élution au centre de la matrice de la colonne sans toucher la paroi interne de la colonne.
2. La purification sur des gels d'agarose :
  • Vérifier la compatibilité du gel d'agarose et la technique de purification. Par exemple, le kit ZymoClean™ Gel Recovery est compatible avec les gels d'agarose TBE ou TAE.
  • Privilégier les peignes équipés de dents moins larges.
  • Limiter le temps d'exposition d'ADN au UV en découpant le plus vite possible la bande d'agarose.
  • Privilégier les gels d'agarose inférieurs à 2%.
  • Veiller à ne pas dépasser 400 mg d'agarose pour la purification. Par exemple, découper l'agarose le plus près possible de la bande d'ADN.
  • S'assurer que le gel d'agarose soit complètement dissous avant la purification sur colonne.
  • Dissoudre l'agarose à 55°C et ne pas dépasser 60°C.
  • Si les fragments d'ADN sont supérieurs à 10 kb, utiliser le kit ZymoClean™ Large Fragment DNA Recovery.
Tutoriels sur les purifications des fragments d'ADN