BONNES PRATIQUES
Tout ce que vous n'avez jamais osé demander pour réussir vos clonages


Kits de clonage – Technologie Gibson®
Initialement réalisées par digestion en présence d’enzyme(s) de restriction de l’insert et du vecteur puis action d’une ligase, par clonage TA ou par recombinaison, les techniques de clonage ont évolué afin de répondre aux besoins des utilisateurs :
•   Cloner dans un site défini du plasmide dépourvu de site de restriction
•   Cloner de façon directionnelle dans le vecteur de son choix
•   Cloner de façon « seamless » sans ajout de base
•   Cloner simultanément plusieurs fragments (par exemple promoteur + gène + tag)
•   Cloner des grands fragments

Exempte des limitations classiquement rencontrées dans les méthodes de clonage traditionnelles, la technologie Gibson® citée dans plus de 4000 publications, est unique dans sa capacité à simplifier les étapes de clonage. Elle assure un taux d’efficacité élevé, y compris pour les clonages difficiles.
PRINCIPE TECHNOLOGIE GIBSON®
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Principe du clonage par assemblage de brins Gibson®
Cette technologie repose sur l’appariement de simple brins générés par le mix Gibson® suite au mélange d’un ou plusieurs inserts et d’un vecteur linéarisé contenant une homologie de séquence en leurs extrémités.
Tout d’abord une exonucléase 5’->3’ produit des brins 3’ sortant permettant l’appariement des séquences homologues.
Les gaps sont ensuite comblés par l’action d’une ADN polymérase hautement fidèle puis ligués, aboutissant ainsi au vecteur recombinant.
Le clone final est obtenu par transformation de cellules compétentes.
Principe du clonage par assemblage de brins Gibson®
CHOISIR SON KIT
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Quel kit Gibson® choisir ?
Les kits Gibson Assembly® correspondent aux versions les plus récentes et celles qui donnent les meilleures efficacités de clonage parmi toutes les versions des kits Gibson® existantes. Ces kits sont issus de la société Codex DNA, créée par l’inventeur de cette technologie, Dan Gibson.
•   Version HiFi
⁃   inserts de 500 pb à 32 kb
⁃   clonage jusqu’à 5 fragments
⁃   protocole en 1 étape
  Version Ultra
⁃   inserts de 100 pb à 100 kb
⁃   clonage jusqu’à 15 fragments
⁃   protocole en 2 étapes
ÉTAPES DU CLONAGE
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Comment designer les amorces pour l’amplification des fragments PCR à cloner ?
Dans la majorité des applications, il est nécessaire d’ajouter 30 ou 40 bases en 3’ des amorces utilisées pour amplifier le produit PCR.
   Plus d’informations dans le protocole Gibson Assembly® HiFi  en page 10.
  Outil en ligne pour le design des amorces

Comment préparer le vecteur ?
•   Linéarisation du vecteur
Digérer le vecteur de façon efficace (100%) avec une enzyme de restriction, idéalement avec deux enzymes.
L’obtention du vecteur sous la forme d’un fragment double brin linéaire peut être également réalisée par amplification PCR à partir du vecteur circulaire. Dans ce cas, une PCR inverse, c’est-à-dire à l’aide d’amorces orientées de façon opposée, est réalisée.

   Purification du vecteur linéarisé
Le vecteur est purifié par « clean-up » ou après isolement sur un gel d'agarose.
Voir la rubrique « Faut-il purifier les produits de PCR sur un gel d'agarose ? » des bonnes pratiques « Purification des fragments d'ADN » valable également pour le traitement du vecteur

Comment préparer le mix de clonage ?
IMPORTANT : vortexer vigoureusement le master mix Gibson Assembly® (2X) pendant 15 secondes immédiatement avant utilisation.
•   De façon générale, on prépare le mix de clonage avec 10-300 ng d’insert(s) et 25-200 ng de vecteur linéarisé soit 25-50 fmol de vecteur.
•   Pour des résultats optimaux, il est nécessaire de respecter un ratio molaire insert/vecteur* :
⁃   1 :1 pour fragments d’ADN >1kb
⁃   5 :1 pour fragments d’ADN <1kb
⁃   Pour le clonage multi-inserts, utilisez un ratio 1 :1 pour chaque insert

* Formules de calcul :
•   fmol ADN = [(ng x 1000) / (bp x 660)] x 1000
•   pmol ADN = [ng DNA/(660 x bp)] x 1000
•   ng ADN = [pmol DNA x (660 x bp)]/1000
avec « ng » quantité d’ADN en nanogrammes et « bp » le nombre de paires de bases de l’ADN double brin
QUESTIONS - RÉPONSES
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Linéarisation du vecteur : quelles enzymes de restriction sont compatibles avec la technologie Gibson® ?
Toutes les enzymes de restriction sont compatibles, celles générant des extrémités 5’ et 3’ sortantes, ainsi que celles donnant des bouts francs.

Comment réduire le bruit de fond dû au vecteur ?
•   Préparez le vecteur par PCR inverse à partir d’un plasmide amplifié dans une souche dam+/dcm+. Après la PCR, traitez le mélange d'amplification avec Dpn I pour digérer l’ADN matrice, puis purifiez le vecteur après migration sur gel.
•   Dans le cas de l’obtention du vecteur par restriction enzymatique, utilisez 2 enzymes. Si cela n’et pas possible et que la digestion est réalisée en présence d’une seule enzyme, traitez le vecteur obtenu par une phosphatase.

Est-il possible d’assembler des fragments linéaires sans vecteur ?
Oui, tant que les deux extrémités du fragment du linéaire final ne partagent pas d'homologie avec les extrémités des fragments internes. Nous n'avons pas testé l'assemblage linéaire de fragments pour des constructions >10 kb.

La technologie Gibson® fonctionne-t-elle pour assembler des séquences répétitives ?
Oui, il sera nécessaire que les séquences répétées soient le plus possible à l’intérieur du fragment à cloner et non aux extrémités. Cette stratégie garantira que chaque fragment d'ADN aura un chevauchement unique et sera assemblé dans le bon ordre. On privilégiera la version Gibson® Ultra en réduisant l’étape de digestion avec l’exonucléase de 1 à 2 min au lieu de 5 min.

Toutes les FAQ - voir page 20 :
PROTOCOLES
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