BONNES PRATIQUES
Tout ce que vous n'avez jamais osé demander pour réussir vos clonages

Cellules compétentes  - Transformation bactérienne
La transformation bactérienne est un processus naturel dans lequel les cellules absorbent l'ADN étranger de l'environnement à une faible fréquence. Après transformation, les cellules peuvent exprimer l'information génétique acquise. Avec l'avènement du clonage moléculaire dans les années 1970, le processus de transformation a été exploité et amélioré pour introduire de l'ADN plasmidique recombinant dans des souches bactériennes rendues « compétentes » ou plus perméables pour l'absorption d'ADN.
Cette étape intervient une fois la réaction de clonage réalisée afin de transformer des cellules avec l'ADN recombinant produit et d'obtenir des clones bactériens.
Elle se déroule en 4 étapes :
•  Préparation des cellules compétentes ou utilisation de cellules compétentes prêtes à l'emploi
•  Transformation
•  Période de récupération cellulaire
•  Étalement des cellules
DÉFINITIONS
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Qu’est-ce que la compétence d’une cellule bactérienne ?
La compétence est la capacité d'une cellule à prélever une molécule d'ADN libre dans son environnement par le phénomène de transformation.

Comment définit-on la compétence d’une bactérie ?
Elle est définie comme le nombre de colonies obtenues après transformation de cellules compétentes et étalement sur milieu sélectif gélosé.
A titre d’exemple, une efficacité de transformation de 109 CFU (Colony Forming Units)/µg d’ADN correspond au nombre de colonies qui sont obtenues après avoir transformé les cellules avec 1 µg d’ADN plasmidique super enroulé de référence (en général pUC19).
CHOISIR SES CELLULES COMPÉTENTES
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Choisir les cellules compétentes adaptées à vos applications et vos flux de travaux de clonage est essentiel pour réussir. Les aspects suivants doivent être pris en compte lors de la sélection d’une souche compétente :
•  Méthodes de transformation – méthode chimique ou technique d’électroporation
•  Efficacité de transformation
 Souches bactériennes et génotypes
•  Applications – expression des protéines, clonage général, construction de banques, etc...
Méthodes de transformation
La procédure chimique classique pour rendre des cellules chimiquement compétentes a montré une perméabilité accrue des cellules bactériennes à l'ADN après un traitement avec du calcium (Ca2+) et une brève exposition à une température élevée, connue sous le nom de choc thermique (optionnel).

Comme approche alternative de la transformation chimique, un champ électrique peut être appliqué aux cellules pour améliorer l'absorption d'ADN, une méthode connue sous le nom d'électroporation.

Les cellules compétentes pour l'électroporation auront des efficacités de transformation les plus élevées ((>1010 cfu/µg), et seront donc adaptées aux clonages difficiles. Avec cette technique, vous devez éliminer les sels de vos cellules compétentes pour éviter tout arc électrique. L'électroporation nécessite également d’être équipé d’un électroporateur.

Efficacité de transformation
Elle sera choisie en fonction de l’usage des cellules compétentes :
•  Pour du sous-clonage ou la transformation de plasmides circulaires, une efficacité de 106 cfu/µg est suffisante
•  Pour la plupart des kits de clonage, une efficacité de 108-109 cfu/µg est requise
•  Enfin pour des clonages difficiles, la construction de banques, il est nécessaire d’utiliser des cellules ayant une compétente d’au moins 1010 cfu/µg

Souches bactériennes et génotypes
Les souches bactériennes utilisées pour la transformation ont été sélectionnées en fonction des mutations de leur génome.

Pour le clonage, les mutations endA1 et RecA1 permettent respectivement :
• d’améliorer le rendement et la qualité de l'ADN plasmidique lors de la purification
• d’augmenter la stabilité des plasmides clonés portant des séquences à répétition directe et aider à prévenir la recombinaison entre l'ADN plasmidique et l'ADNg de l'hôte

Certaines souches bactériennes ont une délétion partielle du gène lacZ dans la région alpha, représentée par lacZΔM15. Les souches avec ce génotype permettent d'effectuer un criblage bleu et blanc après transformation et de prélever facilement les cellules transformées.

Pour l’expression de protéines, les souches adéquates sont déficientes en protéases Lon et OmpT, réduisant ainsi la dégradation et favorisant la stabilité des protéines synthétisées. Elles expriment en général l’ARN polymérase du phage T7 pour l’expression de protéines à partir de plasmides comportant le promoteur inductible T7.



Les souches bactériennes répondent à tout type d'application, comme :
la production d'ADN non méthylé : souches dam-/dcm-


le clonage d’ADN méthylé
La souche Zymo 10B comporte des mutations recA1 et endA1, résultant en un ADN de haute qualité. Elle porte également des mutations pour mcrA, mcrBC et mrr. McrA, codant des enzymes qui font partie des systèmes de restriction-modification dans lesquels se produit la digestion de l'ADN méthylé. Par conséquent, la souche avec ces mutations géniques permet le clonage d'ADN méthylé, en particulier pour le clonage d'ADN génomique eucaryote.

ÉTAPES DE LA TRANSFORMATION
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Préparation des cellules compétentes - Utilisation de cellules prêtes à l'emploi
Les cellules compétentes sont couramment utilisées en laboratoire et avoir des cellules avec une efficacité adéquate est crucial pour toute transformation réussie.

La méthode de base consiste à rendre les cellules compétentes en présence de chlorure de calcium à basse température. Les cellules doivent être conservées au froid tout au long du process. Nous proposons un kit pour préparer des cellules compétentes de haute qualité, le Mix & Go! E.coli Transformation Kit.

Une alternative à la fabrication de cellules compétentes consiste à utiliser des cellules prêtes à l’emploi.
Cela élimine le processus fastidieux et garantit une efficacité de transformation optimale, car elle a déjà été contrôlée et validée.

Nous proposons les cellules compétentes Mix and Go!™ qui ont des efficacités de transformation très élevées allant jusqu'à 109 transformants par µg d'ADN plasmidique et disponibles pour diverses souches, DH5 alpha, Zymo10B, TG1, etc... avec un protocole simple, sans choc thermique et ultra-rapide en 20 secondes.

Pour l'expression de protéines sous contrôle du promoteur T7, nous proposons les cellules Vmax™ X2, conçues à partir de la bactérie marine non pathogène à Gram négatif, Vibrio natriegens. Ces cellules les cellules conservent tous les avantages des systèmes d'expression bactériens traditionnels tout en générant des quantités significativement plus importantes de protéines.

Transformation
Lors de cette étape, le vecteur ou le mix de clonage est mis en contact à froid avec les cellules compétentes pendant 20 sec et jusqu'à 5 min en fonction des cellules compétentes utilisées.
En règle générale, le volume d’ADN ajouté sur les cellules ne doit pas représenter plus de 5% du volume total.
o   Pour les cellules chimiquement compétentes, diluez la réaction de clonage jusqu’à 5 fois en ddH2O de grade biologie moléculaire avant de réaliser la réaction de transformation afin d’éviter d’inhiber la survie des cellules.
o   Pour les cellules électro-compétentes, il est fortement conseillé de diluer le mix de clonage voire de le dialyser
o   Utilisez 2 µL de la dilution pour l’étape de transformation

Pour les cellules chimiquement compétentes, une étape de choc thermique à 42°C pendant 30 sec - 2 min est réalisée. Cette étape n'est pas nécessaire pour les cellules Mix&Go!™.

Période de récupération cellulaire
Cette étape consiste à incuber les cellules après l'entrée de l'ADN avec un milieu nutritif liquide et sous agitation à 37°C pendant 1 heure. Elle est optimale pour la régénération des cellules et pour l'expression de la résistance aux antibiotiques. Cette étape n'est pas nécessaire pour les cellules Mix&Go!™ dans le cas d'une sélection avec l'ampicilline.

Étalement des cellules
Dans cette dernière étape, les cellules sont étalées sur un milieu gélosé sélectif permettant  la sélection des clones recombinants par exemple à l'aide d'un marqueur de résistance à un antibiotique porté par le plasmide transformé. Il est recommandé de préchauffer les boites à >20°C, de préférence 37°C avant l'étalement. En effet des boites réfrigérées réduiront l'efficacité de la transformation des cellules. Après une incubation toute la nuit à 37°C, les colonies apparues seront testées pour vérifier qu'elles contiennent le plasmide recombinant souhaité.

QUESTIONS - RÉPONSES
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Quelle quantité d'ADN dois-je utiliser lors de la transformation bactérienne ?
L'efficacité de la transformation dépend fortement du plasmide (nombre de copies, taille, insert), il n'y a donc pas de quantité générale que nous recommandons, elle peut être différente pour chaque plasmide.
Pour des cellules ayant une efficacité de transformation de 108 - 109 transformants/µg de plasmide, nous ne recommandons pas d'utiliser plus de 100 ng pour une transformation (dans de nombreux cas, beaucoup moins suffit). Par exemple, pour pUC19 (un plasmide très facile à transformer), nous n'utilisons que 10 pg pour transformer 100 µl de cellules. Lorsque nous en étalons 20 µl, nous obtenons plus de 200 colonies.

Quelle taille de plasmide peut être utilisée pour la transformation avec les  cellules compétentes Mix&Go!™ ?
Pour les souches Zymo 5α et Zymo 10B jusqu'à 20 - 32 kb.  
Pour les autres souches, jusqu'à 10-15 kb. Cependant, il est à noter que l'efficacité de la transformation diminue lorsque la taille du plasmide augmente.

Étape de récupération cellulaire - Cellules compétentes Mix&Go!™
Pour un vecteur résistant à l'Amp, les cellules peuvent être étalées sur des boites directement après le mélange ADN/cellule. Pour les autres marqueurs de sélection (Kan, Tet, Cam, etc..), il faut faire une étape de croissance à 37°C : pour quelle raison ?
La raison réside dans les différents modes d'action des antibiotiques. Alors que par exemple la kanamycine et le chloramphénicol empêchent toute synthèse protéique et rendent donc également impossible la traduction de la protéine médiatrice de résistance, les antibiotiques bêta-lactamines (par exemple ampicilline, carbénicilline) n'affectent qu'une transpeptidase nécessaire à la synthèse de la paroi cellulaire.

Par conséquent, lors de l'utilisation d'un antibiotique Amp, la bêta-lactamase médiatrice de la résistance peut être produite dès que la bactérie a absorbé le plasmide, alors qu'avec d'autres marqueurs de résistance, une certaine concentration de protéine de résistance doit d'abord être produite, sinon même les transformants positifs ne pourraient pas pousser une fois étalés sur boite. Il est nécessaire de mettre en culture les bactéries transformées sans pression de sélection. Lors de la sélection avec Kan, Tet, Cam, etc., nous recommandons après l'ajout du plasmide, de laisser les cellules sur la glace pendant 5-10 min, ajouter 4 volumes de milieu SOC et incuber à 37 ° C, sous agitation à  200-300 rpm pendant 1h avant d'étaler sur boite.

Avec quelle souche le kit pour la préparation des cellules compétentes Mix & Go! E.coli Transformation Kit est-il compatible ?
Le kit est optimisé pour les souches d'E.coli K12 et B, et leur dérivés. Pour les autres souches, l’efficacité de transformation obtenue sera plus faible - voir nos conseils pour augmenter l’efficacité de transformations dans les FAQ.

Toutes les FAQ

PROTOCOLES
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