BONNES PRATIQUES
Tout ce que vous n'avez jamais osé demander pour réussir vos clonages

Criblage de clones - PCR sur colonies
DÉFINITIONS
———————
La PCR sur colonies est une technique de PCR simple et rapide réalisée directement à partir de cellules microbiennes.
Généralement ce sont des  bactéries à Gram négatif comme E. coli, mais cela peut être également des bactéries à Gram positif ou des levures. Les cellules microbiennes sont préalablement transformées par un ou plusieurs ADN plasmidiques recombinants. 
APPLICATIONS
———————
Cette technique, plébiscitée pour le criblage de clones suite à un clonage, permet d’identifier les clones positifs contenant le plasmide recombinant avec l’insert cible. Simple et rapide, car l'étape de la purification d’ADN plasmidique est éliminée, elle est compatible avec des analyses à haut-débit où un grand nombre de clones sont à cribler. En fonction de la conception des amorces, la PCR sur colonies peut être utilisée pour vérifier en parallèle la taille ou l’orientation d'un insert.

La fidélité du clonage doit être vérifiée par séquençage. Si le design des amorces permet d’amplifier l’insert cible entièrement, le séquençage peut être réalisé à partir des produits de PCR sur colonies.
ÉTAPES DE LA PCR SUR COLONIES
———————
Il y a 4 grandes étapes pour réaliser la PCR sur colonies comme illustré par le schéma ci-dessous :
Présentation des 4 étapes de PCR sur colonie
1. Préparation des cellules :
Les cellules doivent être cultivées sur un milieu de culture sélectif contenant l’antibiotique approprié permettant la sélection du plasmide recombinant cible. Le prélèvement des cellules est généralement réalisé à l’aide d’une pointe de pipette stérile.

Pour que la PCR sur colonies fonctionne, l’ADN plasmidique doit être libéré dans le milieu réactionnel.
•   Les membranes des bactéries à Gram négatif étant souple, l’ADN plasmidique est libéré pendant l’étape de dénaturation de la PCR.
•   Les bactéries à Gram positif ou les levures dont les membranes sont plus résistantes, une étape de lyse par la chaleur en amont de la PCR est donc recommandée. Par exemple : faire bouillir les cellules en suspension dans de l’eau ultrapure pendant 5 – 10 minutes.

Les clones utilisés pour la PCR sur colonies doivent être conservés pour l’étape de purification du plasmide recombinant. Nous conseillons de mettre les clones en culture en parallèle de leur prélèvement.
2. Préparation du mélange réactionnel :
Le volume du mélange réactionnel doit être au minimum de 50 µl. Les composants du mélange sont les mêmes que pour la PCR classique, sauf pour l’ADN plasmidique qui est remplacé par des cellules (cf. l’étape 1 – Préparation des cellules).  

Même si une Taq DNA polymérase standard peut fonctionner pour une PCR sur colonies, il est recommandé d’utiliser une enzyme de PCR robuste et résistante aux inhibiteurs de PCR comme l’agar, le milieu de culture… Les pré-mélanges de PCR colorés et prêts-à-l’ emploi sont mieux adaptés aux criblages à haut débit.

Le Taq’Ozyme Purple Mix 2 contient une enzyme de PCR robuste, les dNTPs, le tampon de réaction et un colorant pourpre inerte pour la PCR, facilitant la visualisation lors de l’électrophorèse. Ce mix , en format 2 fois concentré, est validé avec succès en PCR sur colonies.

Ci-dessous le mélange réactionnel recommandé pour les PCR sur colonies réalisées avec la Taq’Ozyme Purple Mix 2 (Réf. OZYA007)  :
Le contrôle avec le plasmide parental « vide » sans insert est à inclure à chaque série de PCR sur colonies.
3. Programmation de la PCR :
Deux paramètres de programmation de PCR sont spécifiques à la PCR sur colonies :
•   La conception des amorces
Il y a trois types de conception d'amorce pour la PCR sur colonies. Tous permettent de cribler les clones positifs mais ils permettent d'obtenir des informations supplémentaires sur l’insert cible :
⁃   Les amorces spécifiques de l’insert : vérifier la présence de l’insert et non la localisation de l’insert dans le plasmide.
⁃   Les amorces spécifiques du plasmide : vérifier la taille de l’insert cible et non l’orientation de l’insert.
⁃   Les amorces spécifiques de l’orientation de l’insert : vérifier l’orientation de l’insert. Et non la taille de l’insert.
•   Le programme de PCR
Comme les cellules des bactéries à Gram négatif sont lysées pendant la dénaturation initiale de la PCR, il est important de programmer cette étape pour une durée minimale de 5 minutes. Les étapes d’hybridation et d’élongation sont à déterminer en fonction des amorces et de l’enzyme de PCR utilisées en suivant les mêmes règles que pour la PCR classique.
4. Electrophorèse sur gel d’agarose :
Les résultats de la PCR sur colonies sont analysés par électrophorèse sur un gel d’agarose. Il est conseillé de déposer environs 1/10 du mélange réactionnel de la PCR par puits.
Ci-dessous des exemples de résultats types :
Exemples de résultats types de PCR sur colonie obtenus par électrophorèse sur un gel d'agarose
BONNES PRATIQUES
———————
•   Ne pas prélever trop de cellules, car cela peut inhiber la PCR. Pour éviter qu’il y ait trop de cellules, il est possible de les diluer dans de l’eau ultrapure ou d'augmenter le volume réactionnel de la PCR. Le volume réactionnel recommandé est  de 50 – 100 µl.
•   Utiliser les pointes de pipette stériles pour prélever les cellules. Les cure-dents en bois ne sont pas recommandés à cause d'un possible effet inhibiteur sur la PCR.
•   Prélever les cellules sans toucher l’agar.
•   Travailler avec des cellules fraîches.
•   Les bonnes pratiques pour la PCR classique sont à appliquer pour éviter les contaminations croisées.
QUESTIONS - RÉPONSES
———————
Comment éviter les faux positifs ?
•   Ne pas utiliser les mêmes amorces pour l’amplification de l’insert cible pour la PCR sur colonies. Car les fragments de PCR non ligués se trouvant dans le milieu de culture peuvent être amplifiés pendant la PCR sur colonies.
•   Les amorces spécifiques de l’orientation sont recommandées, car elles permettent non seulement de vérifier l’orientation de l’insert et en plus de diminuer les résultats faux-positifs.
•   Le contrôle négatif utilisant les cellules contenant le plasmide parental « vide » sans l’insert permet d’identifier les faux-positifs liés aux amplifications de l’ADN génomique.

Peut-on amplifier une région longue lors d'une PCR sur colonies ?
Comme pour les PCR classiques, les régions courtes sont amplifiées plus efficacement en PCR sur colonies. Il est possible d’amplifier des régions longues en travaillant avec une enzyme de PCR à la fois « long-range » et robuste. Il faut aussi un programme de PCR optimisé pour les amplicons longs.

Pourquoi je vois aucune bande sur mon gel d’agarose ?
Si les amorces et les conditions de PCR ont été correctement validées, nous conseillons d’optimiser la quantité des cellules :
•   Si les cellules sont ajoutées directement dans le mélange réactionnel, prélever moins de cellules.
•   Si les cellules sont lysées avant la PCR, tester deux conditions en mettant plus (condition 1) ou moins (condition 2) de cellules.  
•   Si l’amplicon est long, redessiner les amorces pour amplifier une région plus courte.