POURQUOI ET COMMENT UTILISER UN ANTICORPS SECONDAIRE EN IF ?
POURQUOI UTILISER UN ANTICORPS SECONDAIRE ?
—————
Pour obtenir un niveau de signal de fluorescence satisfaisant, on doit ajuster sa stratégie de marquage selon l’abondance de la cible à étudier.
Il est très important avant de choisir un protocole (direct-sans anticorps secondaire ou indirect-avec un anticorps secondaire / avec ou sans amplification) de connaître précisément son échantillon et plus particulièrement, l’abondance de la protéine à détecter pour définir le type de détection optimal.

Le marquage direct utilise un seul anticorps primaire directement conjugué pour détecter une protéine d’intérêt. Ce type de marquage implique de disposer d’un primaire conjugué au fluorophore de son choix ou de le conjuguer soi-même. Il n’y a pas d’amplification du signal.

Le marquage indirect utilise au moins deux anticorps :

Un primaire spécifique de la protéine d’intérêt non marqué,
Un secondaire, reconnaissant le primaire, conjugué à un fluorophore ou à la biotine. Dans le cas d’une conjugaison à la biotine, on utilise un troisième anticorps anti-biotine conjugué directement à un fluorophore ou à la streptavidine, elle-même conjuguée à un fluorophore. Un système supplémentaire d’amplification peut aussi être utilisé (ex : tyramide).

On attend entre un marquage direct (primaire directement conjugué à un fluorophore) et un marquage indirect (primaire non conjugué + secondaire conjugué à un fluorophore) une amplification du signal de l’ordre de 3.

Autre alternative, il est aussi possible d’utiliser un primaire biotinylé avec une streptavidine pour amplifier un signal faible. Dans ce cas, cela nécessite une étape de blocage supplémentaire (Lire dans le Techozyme, le paragraphe sur les blocages).


Parfois, on doit faire appel à un niveau encore supérieur d’amplification du signal.
Dans ce cas, on peut choisir la technique d’amplification du signal par la tyramide utilisant l’enzyme HRP (horseradish peroxidase) pour générer un marquage haute-densité. Cette technique s’utilise en marquage indirect avec :

.   un primaire non conjugué,

.   un secondaire-HRP,

.   une incubation avec la tyramide conjuguée à un fluorophore (ici les CF™ Dyes).
    C’est le substrat utilisé ici, qui rend cette technique singulière car le substrat de l’enzyme HRP n’est pas transformé en colorant comme en IHC chromogénique.
    L’HRP va catalyser le dépôt de molécules de tyramides conjuguées à un fluorophore. Puis, les tyramides activées se fixent de manière covalente aux résidus
    tyrosine de l’antigène/cible ou des protéines du voisinage proche. Les fluorophores sont détectés directement.

.   ou une incubation avec la tyramide conjugué à la biotine, suivie d’une streptavidine conjuguée à un CF™ Dye pour amplifier davantage le niveau de signal.
L’amplification par la tyramide permet une augmentation de la sensibilité d’au moins 50 fois par rapport à une détection indirecte classique (primaire + secondaire conjugué).
Schéma montrant l’amplification par la tyramide
QUEL SECONDAIRE CHOISIR EN FONCTION :
—————
- Des fluorophores utilisables sur son microscope

Il est important de choisir de manière judicieuse sa combinaison de fluorophores en fonction :

.   Des filtres disponibles sur son microscope et se renseigner sur les spectres d’absorption/émission de fluorescence
.   Utiliser préférentiellement des fluorophores avec des spectres d’émission étroits et non chevauchants pour s’assurer de la spécificité du signal observé
.   Sélectionner le fluorophore en fonction de l'abondance de la cible. Exemple : prendre le plus brillant pour la cible la moins abondante.
.   Choisir des fluorophores stables (peu de photobleaching) et stabiliser la fluorescence avec un milieu de montage adapté au fluorophore choisi.


Ozyme propose une large gamme d’anticorps secondaires conjugués aux CF™ Dyes qui sont particulièrement stables et brillants. Il existe également des kits de conjugaison Mix-N-Stain™ pour conjuguer vos anticorps au CF™ Dyes. Les CF™ Dyes sont particulièrement recommandés en IF pour leur brillance et leur résistance au photobleaching, notamment comme alternative aux Alexa Fluor®.






- L’abondance de la cible et donc la stratégie d’amplification

- Des problèmes de bruit de fond dus aux récepteurs Fc

Certains types cellulaires ou organes (ex. monocytes, macrophages, lymphocytes B, thymus ou rate,…) ont beaucoup de récepteurs Fc à leur surface. Ceux-ci réagissent avec les immunoglobulines de souris ou de lapin et génèrent un marquage aspécifique. Ces récepteurs Fc peuvent être bloqués par une incubation avec des immunoglobulines provenant de l’espèce des cellules étudiées avant l’immuno-marquage. Une autre solution consiste à utiliser des anticorps secondaires IgG F(ab)'2 purifiés par affinité pour éviter la fixation de la partie Fc aux récepteurs Fc des cellules vivantes.

Anticorps secondaires IgG F(ab)’2 :
Conjugués à la biotine : Biotium  -   Bethyl  -  Immunoreagents



- son niveau de multiplexage

Le multiplexage oblige à optimiser le bruit de fond lié aux « réactions croisées » en IF

Le bruit de fond observé en IF est souvent issu des réactions croisées entre les anticorps utilisés.

Une « réaction croisée » est une réaction obtenue entre un anticorps dirigé contre une espèce envers une autre espèce proche génétiquement. Par exemple, entre bovin/ovin et bovin/caprin.

Une solution contre les réactions croisées entre espèces peut être la cross-adsorption, qui est une déplétion en certaines IgG capables de réagir contre d’autres espèces très proches.
 La source du bruit de fond est souvent due à :

 - la présence d'immunoglobulines dans le tissu étudié : on l'élimine en utilisant des anticorps secondaires purifiés par affinité et cross-adsorbés contre l'espèce du tissu étudié ou multi-cross-adsorbés contre plusieurs espèces proches. Et bien sûr en évitant d’utilisant des anticorps faits dans une espèce sur cette même espèce (souris sur souris appelé communément « mouse-on-mouse »)

 - les anticorps primaires : il est recommandé d’utiliser des anticorps secondaires cross-adsorbés contre toutes les espèces source des anticorps primaires utilisés dans le marquage et conjugués avec différents fluorophores permettant le multiplexage.

 Les anticorps cross-adsorbés contre d’autres espèces peuvent être notés de la manière suivante : « min x w/human, mouse and rabbit IgG/serum proteins » ce qui signifie qu'ils ont été cross-adsorbés contre des IgG ou des protéines du sérum humain, souris et lapin. Ces anticorps permettent de travailler sur une coupe de tissu humain avec un primaire de souris et un primaire de lapin.


On pourra aussi utiliser des secondaires dirigés contre des sous classes d’IgG pour faciliter le multiplexage avec plusieurs primaires d’une même espèce comme la souris - voir les sous-classes  dans le tableau ci-dessous
Classes et sous-classes des isotypiques des anticorps monoclonaux