Questions réponses en immunohistochimie (IHC°
POURQUOI ET COMMENT DÉMASQUER EN IHC ?
COMMENT DÉMASQUER ?
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Quand on fixe un échantillon de tissu avec un fixateur à base de paraformaldéhyde (PFA) ou de formaldéhyde (formol), les protéines de l’échantillon sont cross-linkées de façon covalente. Cela permet de préserver l’architecture du tissu. Cependant un démasquage des sites antigéniques est nécessaire après la fixation car cette dernière induit un changement de conformation des épitopes et donc une mauvaise reconnaissance de l’antigène par l’anticorps correspondant. Le démasquage agirait donc en cassant les liaisons faites entre les protéines lors de la fixation pour les rendre accessibles pour l’anticorps. En effet les aldéhydes réagissent avec les amines des protéines en les activant. Celles-ci réagissent alors avec le groupement phénol des tyrosines en créant des liaisons covalentes. L’état structurelle des protéines en IHC paraffine n’est donc ni vraiment natif, ni vraiment dénaturé.

Les débuts de l’IHC datent des années 40. Le démasquage des sites antigéniques par des enzymes protéolytiques date des années 70. Le démasquage des sites antigéniques par la chaleur a été découvert au début des années 90 et a révolutionné l’immunohistochimie en augmentant considérablement le nombre d’anticorps désormais utilisables sur coupes en paraffine1. Jusqu’à cette époque de nombreuses cibles ne pouvaient pas être détectées en IHC.
De nos jours un traitement enzymatique à la trypsine (par exemple) est assez peu fréquent; alors que le traitement par la chaleur au micro-ondes est beaucoup plus fréquent (quelquefois la cocotte-minute est utilisée pour des antigènes particuliers). Le démasquage des sites antigéniques se fait à une température voisine de 100°C pendant environ 15 minutes dans un tampon citrate ou autre. En effet ce dernier fixe le calcium qui interviendrait dans le renforcement des liaisons covalentes formées lors de la fixation.

Il faut avoir en mémoire qu’il n’y a pas un protocole de démasquage universel pour tous les anticorps et tous les antigènes. Il faut tester et adapter en fonction de la cible et de son anticorps. Elle dépendra aussi de la méthode de fixation utilisée. L’idéal est de ne pas réaliser une fixation trop longue (supérieure à 24 h). Tout cela est assez empirique.

Comparaison des techniques de démasquage d’épitope (HIER et PIER)
Tableau comparant les techniques de démasquage d’épitope
QUELLE TECHNIQUE DE DÉMASQUAGE DES ANTIGÈNES OU ÉPITOPES CHOISIR (NOTÉ AR POUR ANTIGEN RETRIEVAL) ?
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Un nombre important d'antigènes, notamment du fait des modifications conformationnelles de l'épitope liées à la fixation, ne sont pas reconnus par les anticorps correspondants après inclusion en paraffine. Ces difficultés peuvent être contournées en prétraitant les coupes, avant l'application de l'anticorps primaire, par une solution de protéase et/ou en les soumettant à un démasquage thermique.

- Démasquage enzymatique (noté PIER pour Protease Induced Epitope Retrieval)

Premier procédé proposé pour le démasquage des antigènes, si son champ d'application s'est restreint avec le développement des techniques de démasquage thermique, il reste encore indispensable pour un pool réduit de couples antigène-anticorps (c’est le cas pour certains anticorps anti-cytokératines).
L'efficacité des traitements protéasiques varie selon la structure de l'antigène considéré. Les protéases coupent en effet les protéines à des sites spécifiques, or en pratique, nous n'avons jamais connaissance de la séquence antigénique recherchée qui peut potentiellement comporter un site de coupure. Ceci explique en partie que pour un couple antigène-anticorps défini, une protéase peut être plus efficace qu'une autre. La nature du fixateur et la durée de la fixation influencent considérablement la réponse au traitement protéasique, avec pour conséquence une possibilité de digestion insuffisante ou trop poussée. Il faut par ailleurs signaler que d'exceptionnelles modifications antigéniques, sources de non spécificité, ont été rapportées après traitement protéasique. Pour une activité optimale de l'enzyme, les conditions d'incubation des coupes dans la solution de protéase doivent être scrupuleusement respectées : en particulier le pH de la solution, la température de la réaction, et la concentration de l'enzyme qui doit être exprimée en unité et non en mg pour obtenir une reproductibilité d'un lot à l'autre et d'un fournisseur à un autre. Dans les faits, la standardisation d'un traitement protéasique s'avère impossible. A noter que cette technique est réalisée à 37°C, ce qui la rend plus simple à mettre en œuvre.
Les enzymes utilisées sont la trypsine, la pepsine, la pronase, la ficine ou la protéinase K.

Composition des solutions classiques de démasquage enzymatique (PIER) en 1X :
.   pepsine utilisée de 1 mg/ml à 5 mg/ml dans Tris-HCl pH 2,0
.   pronase utilisée de 0,05% à 0,1 % dans du PBS
.   protéinase K à 20 µg/ml (soit env. 0,6 U/ml) en TE pH 8,0 ou en TE-CaCl2 pH 8,0
.   trypsine à 0.05% dans du CaCl2 0,1% pH 7,8
En général on conseille une incubation de 10 à 20 min à 37°C.

Pour les raisons de reproductibilité citées plus haut, il est préférable d’utiliser des solutions de protéases prêtes-à l’emploi.


- Démasquage par la chaleur (noté HIER pour Heat Induced Epitope Retrieval)

Il a révolutionné l'IHC en augmentant considérablement le nombre d'anticorps utilisables sur coupes en paraffine.
Le démasquage thermique est contrôlé par 4 paramètres : la température absolue à laquelle il est effectué, le pH de la solution de démasquage, la nature de la solution de démasquage, la durée du traitement.

a) La température 

Plus la température est élevée, plus le démasquage est rapide et efficace. L'autocuiseur présente un avantage déterminant par rapport au micro-ondes : la température qui y règne est de 118 °C (SEB Clipso®, soupape position 2), elle est homogène dans toute la solution, alors qu'elle est d'environ 100 °C et non homogène dans un four à micro-ondes (un cycle de 5 mn est nécessaire pour homogénéiser la température au sein d'un porte-lame contenant 40 ml de tampon citrate, placé au centre du micro-ondes). Le problème du four à micro-ondes est que chaque modèle de micro-ondes délivre une puissance assez variable. Il faut refaire des tests de calibration si on change de four à micro-ondes. Ce qui va donner une certaine variabilité entre les manipulateurs et les laboratoires. Le bain-marie n’est pas recommandé.
A noter que dans un automate pour l’IHC automatisée ou autostainer, c’est un système de plaque chauffante qui est utilisé.

b)  Le pH de la solution de démasquage
Pour la grande majorité des anticorps, l'intensité du marquage est peu influencée par le pH (de 1 à 10) de la solution. Pour un certain nombre d’anticorps, le pH est critique. Mais il apparaît que la quasi-totalité des anticorps fonctionnels après démasquage thermique répondent à un prétraitement dans un tampon citrate à pH 6 ou plus élevé (mis à part d'exceptionnels anticorps qui ne sont opérationnels qu'après démasquage à pH très acide). Mais au-delà de pH 7,5, se produit une hydrolyse des tissus avec une dégradation marquée de la morphologie.
c)  La nature de la solution de démasquage

De très nombreuses solutions ont été expérimentées et proposées. Quatre d'entre elles ont fait la preuve de leur efficacité :
.   l'urée (10 mM), peu manipulable car s'accompagne d'un dégagement d'ammoniaque lors de l'ébullition (nécessité de travailler sous une hotte)
.   le chlorure d'aluminium (10 mM),
.   les chélateurs du calcium: tampon citrate à 10 mM pH 6,0 et EDTA ou EGTA à 1 mM pH 8,0 et le Tris-EDTA pH 9,0.

Le tampon citrate et l'EDTA fournissent la plus grande sensibilité de marquage associée à une grande reproductibilité. Ils sont par ailleurs simples à préparer. L’efficacité remarquable des chélateurs de calcium repose sur le fait présumé que le calcium, qui est l'ion métallique le plus abondant dans les tissus, intervient en stabilisant et en renforçant le pontage inter et intramoléculaire du formaldéhyde.
Le démasquage thermique en présence d'un chélateur de calcium reposerait sur la rupture des liaisons covalentes établies par le formaldéhyde avec les macromolécules tissulaires grâce à l'énergie apportée par la température élevée et par les ions calcium piégés par le chélateur. Le rôle du calcium semble être démontré par le fait qu'un prétraitement avec une solution de citrate saturée par du chlorure de calcium, aboutit à une extinction du signal immunohistochimique.
A noter cependant que des tissus fixés à l’alcool (qui n’est pas sensé cross-linker les protéines, mais fixer en déshydratant) peuvent aussi bénéficier d’un démasquage. En effet, le fait de retirer les molécules d’eau modifierait aussi la conformation tridimensionnelle des protéines et donc l’épitope. L’HIER permettrait aussi de réhydrater les tissus en restaurant les liaisons non covalentes avec des molécules d’eau et donc de revenir à une conformation plus native de l’épitope.

d) La durée du démasquage
Elle peut être standardisée en routine à 5 minutes avec un autocuiseur (118 °C) et à 3 fois 5 minutes (100 °C) avec un four à micro-ondes. Pour quelques antigènes et notamment les antigènes nucléaires, un gain de signal est obtenu avec un démasquage plus prolongé (15 mn en autocuiseur).
Le démasquage par la chaleur présente par ailleurs des avantages multiples : il est modérément influencé par la nature du fixateur et la durée de la fixation ; la morphologie est de très bonne qualité, avec toutefois des réserves pour certains tissus très riches en collagène ; il s'accompagne d'une diminution du bruit de fond pour certains anticorps ; enfin, aucune induction de réaction croisée ou création de néo-antigènes réactifs n'a été rapportée.
Une standardisation est donc possible pour un pool important d'antigènes à des fins d'analyse qualitative mais non quantitative. 75 à 80 % des antigènes bénéficient d'un démasquage par la chaleur, 20 à 25 % n'en bénéficient pas, mais le traitement n'est délétère que pour un très faible pourcentage d'entre eux.
En pratique, bien qu'il n'existe pas de combinaison optimale : température / solution d'incubation / pH pour tous les anticorps, pour leur grande majorité ils sont opérationnels après un démasquage en autocuiseur pendant 5 mn dans un tampon citrate 10 mM, pH 6,0 ou EDTA 1 mM pH 8,0.
En conclusion, le démasquage thermique a constitué une avancée considérable pour l'IHC sur coupes en paraffine, au même titre que l'utilisation des nouvelles techniques d'amplification de signal.

Protocole de démasquage des antigènes par la chaleur en autocuiseur (SEB Clipso®)
- porter à ébullition le tampon de démasquage (citrate 10 mM, pH 6,0 ou EDTA 1 mM, pH 8,0), couvercle de l'autocuiseur non fermé.
- plonger les lames dans la solution (elles doivent être recouvertes d'un centimètre de tampon). Les lames sont disposées sur des racks métalliques et séparées les unes des autres par un espace de 4 mm pour éviter le piégeage de bulles d'air.
- fermer la cocotte, soupape en position 2.
- dès l'émission de vapeur, compter 5 mn et laisser partir la vapeur.
- placer les lames sous l'eau courante pendant 2 à 3 mn
- transférer les lames dans un tampon Tris et appliquer l'Anticorps primaire.
N.B. :1 00 à 200 lames peuvent être traitées en 12 mn
Le tampon peut être réutilisé pour 5 à 6 traitements en reconstituant le volume initial de la solution avec de l'eau distillée après chaque utilisation

Bien que le démasquage par chauffage marche dans la majorité des cas, il faut noter que ces techniques sont dédiées aux coupes de tissus incluses en paraffine. En effet les coupes congelées ne peuvent pas être traitées par ce type de méthode car elles sont fragiles et seraient détruites par la chaleur. C’est pour cette raison très pratique que la validation d’un protocole d’IHC en paraffine, n’augure rien sur sa fonctionnalité en IHC sur coupes congelées car on n’applique en général aucun traitement de démasquage d’épitope. Elle est à réserver aux antigènes qui ne nécessitent pas de démasquage ou que le fait de ne pas inclure en paraffine améliore la structure 3D de l’épitope. Une méthode existe pourtant, qui consiste à fixer sur tissus frais au paraformaldéhyde, faire immédiatement une étape de démasquage par la chaleur en tampon citrate et ensuite congeler dans la carboglace.

Un point important à soulever est la technique de fixation utilisée. En effet, on a vu que la nécessité de démasquage était directement lié à la fixation utilisée. Il est important de standardiser la méthode de fixation et l’épaisseur des coupes. En effet une fixation trop longue (supérieure à 24 h) peut augmenter les dommages causés à l’épitope et rendre le démasquage habituel inefficace.
A noter également, le démasquage thermique peut provoquer le décollement des coupes de la lame.

De manière générale, référez-vous toujours à la fiche technique de votre anticorps primaire. Si votre anticorps a réellement été validé en IHC, le fabriquant doit au moins vous indiquer la dilution à utiliser et la méthode de démasquage d’antigène à utiliser. Si vous ne disposez d’aucune information commencez tout d’abord par le démasquage par la chaleur en testant les 3 tampons habituels.

Les tampons de démasquage peuvent être préparées au laboratoire ou être achetées en format concentré 10 fois à diluer. Il est toujours important de travailler avec des solutions fraiches.

L’EDTA 1mM pH 8,0 (1X) par exemple peut avoir un pH qui diminue avec le temps. Il convient donc de ne pas en préparer beaucoup à la fois et de vérifier régulièrement son pH.

Composition des solutions classiques de démasquage par la chaleur (HIER) :
- Tampon citrate 10 mM pH 6,0 (1X)
Pour préparer 1L, dissoudre 2,94 g de sodium citrate trisodium salt dihydrate (C6H5Na3O7.2H2O) à dans 1 L de dH2O. Ajuster le pH à 6,0. Cette solution est prête à l’emploi, elle ne doit pas être diluée.

- Tampon EDTA 1mM pH 8,0 (1X)
Pour préparer 1L, dissoudre 0,372 g d’EDTA(C10H14N2O8Na2.2H2O) dans 1L de H2O. Ajuster le pH à 8,0. Cette solution est prête à l’emploi, elle ne doit pas être diluée.

- Tampon Tris EDTA (TE) pH 9,0 (10mM Tris/1mM EDTA) (1X)
Pour préparer 1L, dissoudre 1.21 g de Tris base (C4H11NO3) et 0,372 g d’EDTA(C10H14N2O8Na2.2H2O) dans 950 ml de H2O. Ajuster le pH à 9,0. Cette solution est prête à l’emploi, elle ne doit pas être diluée.

Tampons de démasquage par la chaleur concentrés 10X

Un point important dans le démasquage par la chaleur est le refroidissement, il est très important d’avoir un protocole bien standardisé à cette étape pour obtenir des résultats reproductibles. On conseille de laisser les lames refroidir 30 min sur la paillasse à la sortie du micro-ondes ou de l’autocuiseur.

Si vous travaillez en IHC automatisée et non plus en IHC manuelle, il existe des modules « plaque-chauffante » sur les machines permettant de réaliser un démasquage par la chaleur. Référez-vous aux recommandations du fabriquant de la machine pour optimiser vos protocoles.

Comme nous l’avons vu plusieurs solutions simples s’offrent à vous. Choisissez en fonction de vos contraintes techniques.
BIBLIOGRAPHIE
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1 Shi SR, Key ME, Kalra KL. Antigen retrieval in formalin-fixed, paraffin-embedded
tissues: an enhancement method for immunohistochemical staining
based on microwave oven heating of tissue sections. J Histochem Cytochem
1991;39(6):741-748.