Question/Réponse en Western Blot : aucune bande obtenue
QUESTION / RÉPONSE TECHNIQUE
QUESTION
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Je voudrais faire un double marquage en ImmunoFluorescence (IF) avec 2 anticorps primaires de lapin avec :

.   Un 1er primaire  monoclonal de lapin directement conjugué à un fluorophore
.   Un 2nd primaire monoclonal de lapin non conjugué détecté par un secondaire anti-lapin conjugué à un autre fluorophore

Est-ce que le secondaire risque de reconnaitre le 1er primaire de lapin déjà conjugué et générer du bruit de fond ?
RÉPONSE
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Pour éviter ce problème, on doit faire un marquage séquentiel. On réalise le marquage indirect en premier (anticorps primaire non conjugué + secondaire conjugué) puis en second le marquage direct (anticorps primaire conjugué). Mais cela ne règle pas entièrement le problème car les anticorps classiquement utilisés sont de IgG (H+L) ou des F (ab’) 2 divalents (ils ont 2 sites de reconnaissance). Le risque est donc que tous les sites de reconnaissance du secondaire ne soient pas utilisés. Il peut donc fixer le primaire conjugué ajouté en second et l’empêcher de se fixer à l’antigène cible et créer du bruit de fond. 
La solution est donc de bloquer les sites de reconnaissance du secondaire qui restent inutilisés après la première étape en ajoutant un isotype contrôle non conjugué (IgG monoclonal de lapin #3900S ou F (ab’) 2) qui va bloquer tous les sites restants du secondaire. On réalise ensuite le marquage direct.

Voici un résumé du protocole à suivre :
1. marquage indirect :
.   primaire de lapin non conjugué
.   secondaire anti-lapin conjugué

2. blocage des sites inutilisés du secondaire par un isotype contrôle IgG ou F (ab’) 2 de lapin

3. marquage direct :
.   primaire de lapin conjugué

On peut faire de même avec des anticorps de souris, mais la souris qui possède des isotypes différents pose généralement moins de problème : isotypes contrôles de souris.