TECHOZYME
COMMENT ADAPTER VOS CONDITIONS DE PCR AUX TAQ'OZYME
Les Taq’Ozyme (Taq’Ozyme, Taq’Ozyme HS et Taq’Ozyme Purple Mix) ont été sélectionnées dans l’objectif de vous offrir des produits robustes et faciles à utiliser, nécessitant peu voire pas d’optimisation. Néanmoins, un protocole optimal pour une Taq n’est pas obligatoirement adapté à une autre et, demande parfois quelques ajustements.

Découvrez dans ce TechOzyme nos solutions vous permettant de travailler dans les meilleures conditions avec les Taq’Ozyme :
SUGGESTIONS POUR UTILISER LES TAQ'OZYME
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Conseils pour une première utilisation :
► Ajoutez la Taq’Ozyme sans modifier votre mélange réactionnel habituel (même quantité d’enzyme, de matrice, d’amorces et de dNTP), ni le volume final
► Programmez votre réaction de PCR en suivant les recommandations indiquées dans le manuel d’utilisation de la Taq’Ozyme

Une astuce d’optimisation :
Faites un gradient de température avec la Taq’Ozyme. En effet, la température d’hybridation optimale dépend des Tm des amorces mais également du tampon de réaction de la PCR qui sont rarement identiques d’une Taq à l’autre. Identifier la meilleure température d’hybridation repose aussi sur les performances du thermocycleur pour générer un gradient précis et linéaire, plus…  

Pour aller plus loin :
Vous souhaitez améliorer le rendement :
►  Augmentez le nombre de cycles de la PCR ou le temps d’élongation
►  Optimisez la quantité d’enzyme (jusqu’à 5 u/50 µl), de matrice et/ou de magnésium (de 1 à 5 mM)
 
Pour augmenter la spécificité :
► La diminution de la concentration en magnésium augmente la spécificité. En effet, un excès de magnésium favorise les hybridations non spécifiques
►  Réalisez un gradient de température d’hybridation
►  L’utilisation de la Taq’Ozyme HS peut éliminer efficacement les dimères d’amorces  

Pour amplifier une région GC-riche :
► Essayez les additifs de PCR qui déstabilisent les régions GC-riches tels que : DMSO, la bétaine...

Pour vous débarrasser des inhibiteurs de PCR :
►  Précipitez votre matrice d’ADN à l’éthanol peut suffire pour les éliminer
QUESTIONS FRÉQUEMMENT POSÉES
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J’obtiens un « smear » : que dois-je faire ?
►  Vérifiez le design de vos amorces
► Augmentez la température d’hybridation et/ou diminuez le temps d’hybridation
►  Essayez la PCR « TouchDown » (voir le saviez-vous ?)

 Je souhaite faire de la PCR sur colonies, quelle Taq’Ozyme recommandez-vous ?
► La Taq’Ozyme Purple Mix. Lire la note d’application.

 Quelle est l’enzyme la plus adaptée pour la PCR multiplex ?
► La Taq’Ozyme HS. Lire la note d’application…

 Pour amplifier une région très longue, est-ce que je peux utiliser l’une des Taq’Ozyme ?
► Si vous travaillez avec des matrices de faible complexité (plasmide ou ADN de lambda) utilisez les Taq’Ozyme pour amplifier jusqu’à 6 kb
►  Pour une matrice plus complexe comme l’ADN génomique humain, choisissez la Taq’Ozyme HS (jusqu’à 5 kb)
►  Au-delà, nous vous suggérons les Taq « longue distance » comme RANGER DNA Polymerase (ADN génomique amplifié jusqu’à 25 kb)
LE SAVIEZ-VOUS ?
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Pourquoi optimiser la concentration de magnésium :
► La concentration de magnésium libre dans une réaction de PCR est influencée entre autre par la concentration d’ADN, de dNTP, de chélateurs (ex. EDTA or citrate) … Par conséquent, si vous modifiez la concentration de l’un de ces composants, il est souhaitable de ré-optimiser la concentration de MgCl
► La solution de MgCl devient hétérogène après plusieurs cycles de congélation/décongélation. Il est recommandé de bien la mélanger (vortex) avant utilisation

En présence de DMSO, il est nécessaire de diminuer la température d’hybridation pour rester en conditions optimales : 10% de DMSO diminue de 5 à 6°C la température d’hybridation.

La PCR « TouchDown » consiste à commencer avec des températures d’hybridation élevées lors des premiers cycles assurant une forte stringence pour une amplification spécifique. Au cours des premiers cycles, la température d’hybridation descend progressivement (ex. 1-2° C tous les deux cycles).

Exemple : programme « TouchDown » dans le cas d’un Tm d’amorce de 62°C :
► Démarrer à 65 °C en diminuant la température d’hybridation de 1°C tous les deux cycles jusqu’à 55 °C
► Puis 15 cycles à 55° C