TECHOZYME
COMMENT OBTENIR DES RÉSULTATS D'IHC DE QUALITÉ PUBLICATION AVEC LES ANTICORPS CELL SIGNALING TECHNOLOGY (CST)
Cell Signaling Technology (CST) produit des anticorps de haute qualité pour l’ImmunoHistoChimie (IHC), développés et rigoureusement validés dans leur laboratoire selon des protocoles établis : plus de 1000 anticorps CST validés pour l’IHC sont disponibles

Il n’existe pas de protocole « universel » utilisable quelque soit l’anticorps pour les différentes applications, y compris l’IHC. C’est pourquoi, nous recommandons de suivre le protocole validé par CST et non votre protocole habituel. CST propose 2 protocoles IHC optimisés à utiliser avec leurs anticorps, mais avec des variantes propres à chaque anticorps à lire sur la fiche technique fournie :
QUELLES SONT LES ÉTAPES DE VALIDATION DES ANTICORPS CST POUR L’IHC ?
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Spécificité vérifiée :
.   Par Western blot : bande présente au poids moléculaire attendu et en présence d’un minimum de bandes contaminantes
.   Par IHC envers la cible : à partir de culots cellulaires de lignées contrôles incluses en paraffine et exprimant la cible antigénique
.   Par utilisation de peptides bloquants pour valider la spécificité du marquage
.   Par traitement phosphatase pour vérifier la phospho-spécificité

Reproductibilité : chaque lot produit est testé

Performances de l’anticorps validées :
.   Sur des « cancers-modèles » chez la souris
.   Sur des xénogreffes générées à partir de lignées cellulaires exprimant la cible antigénique
.   Sur un large panel de tissus cancéreux humains (tissus « arrays »)

Ces contrôles permettent de déterminer les dilutions et protocoles à utiliser (voir fiche technique)

En complément, des réactifs contrôles sont disponibles.

POINTS CRITIQUES DU PROTOCOLE
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Plusieurs points critiques sont à respecter pour obtenir un rapport signal/bruit de fond optimal.

Dans le cas de coupes en paraffine
.   Démasquage de l’épitope : bouillir les lames (au bain-marie, micro-onde ou à l’autocuiseur) dans le tampon validé par CST (tampon citrate, EDTA, TE ou
    digestion par la pepsine). Voir fiche technique

Dans le cas de coupes congelées ou en paraffine
.   Utilisez toujours des coupes fraîchement préparées
.   Incubation avec l’anticorps primaire, suivre les conditions validées :
.   La dilution préconisée de l’anticorps : voir fiche technique
.   Le choix du tampon de dilution :
.   TBST/5% NGS (réf. #9997 & #5425)
.   Plus…
.   Les conditions d’incubation : 4°C la nuit ou 37°C pendant 2 heures (liste des anticorps validés)
  Détection
.   Le système ABC est classiquement utilisé pour la détection. Pour éviter les bruits de fond dus aux lectines et aux biotines endogènes, CST recommande  l’utilisation du SignalStain® Boost IHC Detection Reagent :
.   Plus…
.   CST suggère d’utiliser le substrat ou molécule chromogénique DAB (réf. #8059) validé avec leurs anticorps et assurant un meilleur marquage
.   Il est important de suivre les conditions optimales d’utilisation des anticorps pour garantir vos résultats, et éviter la perte de vos échantillons

Comment retrouver ces préconisations sur la fiche technique ?
Fiche technique CST, pour y retrouver toutes les préconisations
QUESTIONS FRÉQUEMMENT POSÉES
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.   Pourquoi un anticorps validé en Western Blot ne fonctionne-t-il pas automatiquement en IHC ?
.   En WB un anticorps reconnaît un antigène sous sa forme dénaturée tandis qu’en IHC il reconnaît un antigène natif. Une validation par application est donc

.   CST développe t-il des anticorps validés en IHC pour des applications de diagnostic ?
ASTUCES D'OPTIMISATION
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.   Utilisez des contrôles pour valider la spécificité de l’anticorps utilisé : CST propose des lames contrôles SignalSlide® IHC Controls
.   Ne négligez pas les étapes de blocage pour optimiser la détection :
.   Blocage de la péroxidase endogène si l’enzyme HRP est utilisée pour la détection : incubation des coupes 10 min dans du peroxide d’hydrogène 3%
.   Blocage de la biotine endogène si vous utilisez un système de détection à base de biotine (système ABC). Pour éviter cette étape et améliorer la sensibilité en
    éliminant le bruit de fond et les faux positifs dus à la biotine endogène, CST recommande le réactif SignalStain® Boost IHC Detection Reagent.
    Comparaison du système ABC au SignalStain® Boost
.   Blocage du marquage non spécifiquavec du sérum normal de chèvre (NGS) : incubation des coupes 1 heure à température ambiante dans du TBST/5%
    NGS (réf. #9997 & #5425)
.   Pour toutes les autres étapes (déparaffinage, fixation, contre-marquage, montage) suivez scrupuleusement les conseils de CST