TECHOZYME
COMMENT OBTENIR DES RÉSULTATS SENSIBLES ET FIABLES EN PCR QUANTITATIVE
EN TEMPS RÉEL ?
La PCR quantitative (qPCR) en temps réel permet de mesurer une amplification tout au long de la réaction. A chaque cycle d’amplification, la quantité d’ADN est mesurée grâce à un marqueur fluorescent dont l’émission est directement proportionnelle à la quantité d’amplicons produits. Ceci permet d’obtenir une cinétique de la réaction et donc la quantification de l’ADN tandis que la PCR en point final donne une mesure finale. La RT-qPCR permet l’étude de l’expression de gène en mesurant l’abondance de l’ARN (ARNm, microARN …).

Découvrez à travers ce TechOzyme ce qu’il faut savoir pour obtenir des résultats fiables et sensibles : bien choisir sa sonde, son premix de qPCR, son/ses gène(s) de référence pour corriger les fluctuations. Des notions de calcul de quantification et d’efficacité des réactions de qPCR y sont aussi abordées.
SONDES DE DÉTECTION
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Plusieurs systèmes de détection sont utilisés pour la détection ou quantification du signal fluorescent en temps réel :
•   Les sondes chimiques ou non spécifiques : agents intercalants, non spécifiques d’une séquence cible, peu toxiques pour la PCR. Fluorescents à l’état libre et augmentant en fluorescence lorsqu’ils sont liés à l’ADN double brin. Le SYBR® Green I est la sonde chimique la plus utilisée.

•   Les sondes spécifiques : séquences courtes d’ADN simple brin spécifiques d’une cible. La plus utilisée est la sonde TaqMan® basée sur l’activité 5’-exonucléasique de la Taq DNA polymérase pour hydrolyser une sonde hybridée à sa séquence cible sur l’amplicon durant l’étape d’hybridation/extension. Ces sondes sont marquées à leur extrémité 5’ par un fluorochrome émetteur (« reporter ») (ex. FAM) et en 3’ par un fluorochrome suppresseur (« quencher ») fluorescent (ex. TAMRA) ou non (ex. NFQ-MGB) inhibant l’émission du reporter lorsqu’ils sont à proximité. Au cours de la PCR, si la sonde est hybridée sur sa cible, elle est hydrolysée par la Taq ADN polymérase. Le reporter ainsi séparé du suppresseur émet un signal proportionnel au nombre de sondes hydrolysées, mesurable au moment de l’élongation.
ANALYSE DES RÉSULTATS
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Comment déterminer les Ct ou Cq :
Si l’on suit la fluorescence au cours d’une PCR en temps réel, on observe une augmentation de cette fluorescence et donc du nombre de fragments PCR en 4 phases distinctes :
1- Phase de bruit de fond : la quantité de fragments amplifiés est insuffisante pour générer un signal fluorescent supérieur au bruit de fond

2- Phase exponentielle : la quantité de fragments amplifiés génère un signal fluorescent supérieur au seuil de détection de l’appareil, puis le nombre de produits amplifiés double à chaque cycle. En échelle logarithmique, cette phase est représentée par une droite
Détermination des Ct ou Cq: suivi de la fluorescence lors de la qPCR - Représentation de la phase exponentielle
3-  Phase linéaire : certains composants de la réaction (comme le nombre de molécules de Taq disponibles) deviennent limitants, le système ne permet plus une amplification exponentielle

4-   Phase de plateau (ou de saturation) : l’amplification est arrêtée en raison de l’absence complète de l’un des composants de la réaction
Pour quantifier un échantillon par PCR en temps réel, on détermine le nombre de cycles à partir duquel le produit de PCR est détectable. Le moment d’apparition de ce signal seuil dénommé cycle seuil ou Ct (Cycle Threshold) est dépendant de la quantité de matrice initialement présente dans l’échantillon amplifié. Le Ct calculé est inversement proportionnel au logarithme décimal du nombre de copies initiales et apparait toujours pendant la phase exponentielle de la PCR.
Détermination des Ct ou Cq: suivi de la fluorescence lors de la qPCR - Représentation de la phase de plateau (ou de saturation)
Quantification absolue et quantification relative (ΔΔCt) :
La quantification absolue permet de déterminer la quantité ou le nombre de copies d’un ADN dans un échantillon à l’aide d’un ADN étalon dont la quantité ou le nombre de copie sont connus.

La quantification relative est souvent utilisée pour comparer le niveau d’expression d’un gène-cible dans deux conditions expérimentales (ex. échantillon traité et contrôle). De plus, une normalisation du niveau d’expression du gène-cible étudié est nécessaire. Un ou plusieurs gènes ubiquistes, dont les expressions sont constantes dans les conditions expérimentales, sont utilisés comme gène de référence pour normaliser, éliminant les fluctuations. La méthode la plus utilisée est le calcul de ΔΔCt. Voici un exemple de calcul de ΔΔCt :

1 : Comparaison entre deux conditions expérimentales (condition expérimentale « exp » et condition de contrôle « ctl ») :
          Ct gène-cible (exp) – Ct gène-cible (ctl) = ΔCt gène-cible
          Ct gène-réf (exp) – Ct gène-réf (ctl) = ΔCt gène-réf

2 : Normalisation par rapport au gène de référence
          ΔCt gène-cible - ΔCt gène-réf ΔΔCt gène-cible

3 : Détermination de la variation du nombre de copie du gène-cible : Facteur de variation = 2-ΔΔCt. Donc si le ΔΔCt = -2, la variation du niveau d’expression du gène-cible dans les conditions expérimentales versus les conditions contrôles est de 4 fois.
LA qPCR EN MULTIPLEX
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La qPCR en multiplex est réalisable si une sonde spécifique à hydrolyse telle que TaqMan® est utilisée. Celle-ci est spécialement intéressante pour les contrôles qui peuvent être amplifiés en même temps que la cible, limitant ainsi les variations. La spécificité et l’efficacité de la qPCR en multiplex sont deux facteurs essentiels à valider. Les fluorophores choisis doivent être compatibles avec votre appareil de qPCR.
COMMENT COMPARER LES DIFFÉRENTS MÉLANGES DE qPCR ?
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Pour choisir le prémix de qPCR le plus adapté à votre expérience, il est nécessaire de :
•   Comparer pour chaque prémix les caractéristiques suivantes : l’efficacité, la linéarité de la courbe standard, la sensibilité, la spécificité et la gamme dynamique
•   Réaliser ses essais de comparaison en parallèle et en respectant le protocole recommandé pour chaque prémix
•   Tester aussi un gène faiblement exprimé en même temps que le gène de ménage ou de référence habituellement utilisé

Nous déconseillons de tester les différents prémix de qPCR sur une même plaque, car le programme de qPCR utilisé n’est pas optimal pour tous, et certains premix peuvent être favorisés.
MIQE GUIDELINES : LES INFORMATIONS MINIMALES REQUISES POUR LA PUBLICATION DE VOS RÉSULTATS DE PCR QUANTITATIVE
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Publication le MIQE dans Clinical Chemistry présentant les standards requis pour publier ses résultats en PCR quantitative
En 2009, Bustin et al. ont publié le MIQE dans Clinical Chemistry présentant les standards requis ce qui permet, d’une part, aux auteurs de concevoir et de décrire leur expériences de qPCR et, d’autre part, aux rapporteurs et éditeurs d’évaluer plus facilement la qualité des publications soumises grâce aux critères préalablement établis. Ce guide MIQE a été cité 1546 fois par les publications scientifiques de renom.
QUESTIONS FRÉQUEMMENT POSÉES
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Que dois-je utiliser : SYBR® Green ou une sonde TaqMan® ?
La détection par sonde spécifique (ex. TaqMan®) est plus sensible que la détection par intercalant (ex. SYBR® Green) et permet de travailler en multiplex pour détecter en simultané la cible et le gène de référence. La sonde SYBR® permet d’établir une courbe de fusion après la qPCR pour vérifier la spécificité de la réaction de qPCR contrairement à l’utilisation d’une sonde de type TaqMan®.

Quel(s) gène(s) ubiquitaires de référence utiliser pour mon expérience ?
Le gène ubiquitaire de référence est celui dont le niveau d’expression dans vos échantillons est toujours constant quelles que soient vos conditions expérimentales. Nous conseillons de choisir plusieurs gènes de référence pour la fiabilité de vos résultats.

Comment déterminer l’efficacité de vos qPCR ?
Les méthodes de calcul de quantifications absolues ou relatives les plus utilisées ne prennent pas en compte l’efficacité de la qPCR et supposent qu’elle est proche de 100%. Même si une efficacité supérieure à 80% est acceptable, une efficacité à 100% est très importante pour la détection de faibles variations. Comme il est pratiquement impossible de mesurer l’efficacité de la PCR pour toutes les réactions, nous conseillons de vérifier les efficacités de vos qPCR dans le cas de nouveaux gènes cibles et/ou de nouveaux prémix de qPCR.
La méthode la plus courante est d’établir une courbe standard liant les logarithmes de la quantité d’ADN standard (logQ) en abscisse aux valeurs de Ct en ordonnée. La pente permet de calculer l’efficacité de la qPCR selon la formule :
          Efficacité (%) = (10(- 1/pente) –1) x 100%
Par exemple : si la pente est égale à -3,33, l’efficacité est de 100%. Nous conseillons de réaliser au moins 5 dilutions en duplicata.
Efficacité des qPCR : Représentation d’une courbe standard (logarithmes de la quantité d’ADN standard en abscisse - En ordonnée valeurs de Ct)
Est-ce que le traitement par l’uracil DNA-glycosylase est indispensable pour la qPCR ?
Non, la qPCR est généralement réalisée en tubes fermés et la quantification ne requiert aucune manipulation post-amplification ; les problèmes de contamination post-PCR par les amplicons sont significativement réduites.

Dois-je utiliser du ROX ?
Cela dépend de l’appareil de qPCR utilisé. Consulter notre tableau de compatibilité des appareils de qPCR