TECHOZYME
DÉCOUVREZ LES OPTIMISATIONS POUR CONCEVOIR VOTRE PANEL MULTI-COULEURS ET POUR LA FIABILITÉ DES RÉSULTATS
L’augmentation du nombre de marqueurs dans un panel multi-couleurs exige qu’un ensemble de règles soit suivi pour assurer une sensibilité optimale et une cohérence des résultats entre différents échantillons analysés et au cours du temps. En effet, plus le nombre de marqueurs étudiés est grand, plus le risque de chevauchement spectral croit, ce qui complexifie la mise en œuvre du panel et l’analyse des résultats.

Ce TechOzyme décrit comment optimiser la conception d’un panel multi-couleurs, l’importance d’utiliser des contrôles appropriés et donne accès à des outils en ligne.
SPÉCIFICATIONS DU CYTOMÈTRE
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Il s’agit de comprendre les caractéristiques de son cytomètre pour l’utiliser efficacement, en se référant au manuel d’utilisation et au logiciel fournis avec l’appareil. Attention, toutefois, certains instruments sont configurés à façon et ne présentent plus les mêmes caractéristiques des modèles standards.

Connaitre les spécifications techniques de son cytomètre, c’est prendre connaissance :
•   Des lasers disponibles (longueurs d’onde d’excitation)
•   Des spécifications des détecteurs et des filtres associés pour chaque photomultiplicateur de l’instrument (longueurs d’onde d’émission)

Ceci est nécessaire pour définir quels fluorophores peuvent être associés ou non dans son panel expérimental.
•   Exemple de configuration optique d’un cytomètre équipé d’un laser violet (405 nm)
PROPRIÉTÉS SPECTRALES DES FLUOROPHORES
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Dans les expériences de cytométrie multi-couleurs, le chevauchement de spectres est l’un des facteurs les plus importants affectant la qualité de la résolution. Il est donc recommandé de choisir des fluorophores générant des émissions avec peu de recouvrement de spectre : par exemple, le Brilliant Violet™ 421 et le Pacific Blue™ ont des spectres d’émission sensiblement différents, mais qui néanmoins présentent un chevauchement significatif, et il est donc déconseillé de les utiliser ensemble. De manière générale, plus les spectres d’émission sont éloignés, moins il y a de risque de chevauchement, mais c’est fluorophore dépendant. ll est aussi possible pour contourner ce problème d’utiliser les fluorophores sur des lasers différents.
MEILLEUR COMPROMIS ENTRE L’EXPRESSION DE L’ANTIGÈNE CIBLE ET LA BRILLANCE DU FLUOROPHORE
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Il s’agit de trouver un équilibre entre le niveau d’expression de l’antigène à détecter et le niveau de fluorescence (brillance) du fluorophore à utiliser.
Avant de choisir une combinaison particulière fluorophore/anticorps, il faut donc connaitre le niveau d’expression de l’antigène que l’on souhaite détecter.
Les cibles à étudier sont d’abord identifiées, puis catégorisées en 3 niveaux en fonction de leur niveau d’expression :
•   Antigènes de 1er niveau : marqueurs fortement exprimés sur les cellules cibles, comme par exemple les marqueurs phénotypiques de surface, CD3, CD4, CD8, CD56, CD11c et CD16.

•   Antigènes de 2nd niveau : marqueurs dont l’expression est plus variable. Dans ce cas, la sélection des fluorophores d’un panel doit permettre un phénotypage plus distinctif pour identifier des sous-types de population (exemple : cytokines). Les fluorophores à choisir doivent être faiblement brillants.

•   Antigènes de 3ème niveau : ces marqueurs peuvent avoir des niveaux d’expression très variables et parfois complètement inconnus (facteurs de transcription, anticorps phospho-spécifiques ou d’hybridomes faits maison). Pour la détection de ces antigènes, les fluorophores les plus brillants sont utilisés.

•   Un exemple

•   Connaitre le niveau d’expression de marqueurs communs des différents types de cellules immunitaires humaines, consultez le tableau
OPTIMISATION DES CONTRÔLES
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Il est essentiel d’utiliser des contrôles appropriés pour assurer la cohérence des résultats.

•   Les contrôles monomarqués : cellules monomarquées qui sont utilisées pour régler le voltage ou gain des photomultiplicateurs du cytomètre. Ce réglage est nécessaire au début de l’acquisition pour s’assurer que les événements mesurés sont à l’échelle et dans l’échelle linéaire du photomultiplicateur. Cela permet au final de déterminer la limite entre les événements positifs (population positive) et négatifs (population négative).

•   Les contrôles de compensation : ils doivent être réalisés à chaque essai pour assurer l’exactitude des résultats. Idéalement, l’utilisation de billes de compensation assure qu’il y a autant d’événements dans les pics positif et négatif pour remplir précisément l’algorithme de compensation. Il est très important d’utiliser sur les billes de compensation le même anticorps que pour les échantillons. En effet, les fluorophores dits tandem comme l’APC-Cy7 sont très sensibles à la lumière lors du marquage des échantillons. Dans l’exemple de l’APC-Cy7, l’accepteur Cy7 a tendance à « photobleacher », ce qui modifie le degré de recouvrement spectral de l’APC-Cy7 dans l’APC. Au cours du marquage, les billes de compensation marquées ne sont pas traitées de la même façon que les cellules. Par exemple, elles ne subissent pas les mêmes étapes de fixation / perméabilisation que les cellules ou encore pas la même exposition à la lumière. De ce fait, on réalisera plus des contrôles biologiques ou témoins simple marquage qui sont beaucoup plus précis.

•   Les isotypes contrôles : ils sont recommandés pour chaque expérience de cytométrie en flux quand on suspecte notamment des liaisons non spécifiques. Un bon exemple est l’utilisation d’isotype contrôle sur des populations cellulaires circulantes dans l’environnement biologique comme les monocytes et les macrophages. C’est important de déterminer qu’un signal même faible n’est pas un artéfact, et qu’il y a bien discrimination entre population positive et négative.
QUESTIONS FREQUEMMENT POSÉES
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Peut-on utiliser des fluorophores dits tandem sans risque ?
Un fluorophore dit tandem est composé de 2 molécules fluorescentes attachées de façon covalente, dont l’une sert de donneur et l’autre d’accepteur. Le tandem se comporte comme un fluorophore unique avec les propriétés d’excitation de la molécule donneur et les propriétés d’émission de la molécule accepteur. Cela est possible grâce au phénomène de Transfert d’Energie par Résonance de type Förster ou FRET : suite à l’excitation du donneur, il transfère toute son énergie à la molécule accepteur qui est excitée à son tour et qui produit une émission fluorescente. Les fluorophores tandem ont certaines limitations :
•   L’efficacité du FRET n’est jamais de 100 %, ce qui signifie que l’on peut observer de l’émission de la part de la molécule donneur détectée dans son propre photomultiplicateur. Le niveau de cette émission dépend de la qualité des tandems. Pour palier à cela, il est recommandé d’utiliser des isotypes contrôles et un contrôle avec une seule couleur pour ajuster convenablement les réglages de compensation.

•   Les tandems (PE/Cy5, PE/Cy7, APC/Cy7) doivent être utilisés avec prudence car ils sont reconnus pour être facilement dégradés ou pour se « découpler », entrainant une perte d’émission par l’accepteur et une augmentation de l’émission par le donneur. Il y a plusieurs causes qui peuvent générer une perte de transfert FRET à la molécule-accepteur :
•   L’exposition à la lumière, principale cause, qui conduit au « photoblanchiment » des molécules donneur et accepteur
•   La fixation

Quelles sont les astuces pour utiliser avec succès les tandem ?

•   Éviter les expositions prolongées des tandems à la lumière et aux températures élevées. Il est donc important de protéger les échantillons et les anticorps couplés aux tandems pendant toute la durée de l’expérience de cytométrie en flux.

•   Il est contre-indiqué de congeler les anticorps couplés aux tandems entraînant la dénaturation de la molécule donneur.

•   Éviter les temps de fixation prolongés : les tandems doivent être fixés sur de courtes périodes (moins de 30 minutes), puis lavés et repris dans du tampon Cell Staining Buffer pour leur stockage.

•   Il est conseillé de marquer ses cellules à 4°C ou sur glace. Les tandems APC notamment sont plus sensibles au découplage et le fait de travailler à basse température permet de préserver leur stabilité.

La fixation affecte t-elle les fluorophores ?
La fixation au paraformaldéhyde tend à décroître l’intensité de fluorescence des anticorps, particulièrement suite à une exposition prolongée. Ceci est particulièrement vrai pour les nanocristaux et les tandems comme ceux dérivés du PE et de l’APC. Une fixation excessive peut altérer la conformation des protéines, entrainant une perte de réactivité des anticorps.

Quels tampons dois-je utiliser dans mon expérience de cytométrie en flux ?
Il est recommandé d’utiliser les tampons conseillés dans votre protocole fourni avec l'anticorps.

Puis-je utiliser un anticorps à une concentration inférieure à celle recommandée ?
Il est toujours conseillé de titrer son anticorps au début de chaque expérience car dans certains cas, il est possible d’utiliser moins d’anticorps, mais ce n’est pas systématique. Si on change de cellules, il est également conseillé de re-titrer.

Comment est déterminée la concentration optimale d’utilisation d’un anticorps dans une expérience de cytométrie en flux ?
En général, 4 à 6 dilutions sont testées avec les cellules cibles les plus communément utilisées et des courbes de titration sont réalisées afin de déterminer la concentration optimale sur la base du ratio signal/bruit de fond. La dilution ou concentration optimale de l’anticorps choisie est celle juste avant la décroissance du ratio.

Quelle est la concentration/quantité d’isotype contrôle à utiliser ?
Il faut utiliser la même concentration / quantité que pour l’anticorps primaire. Attention, comme les concentrations des anticorps primaires et de leurs isotypes correspondants ne sont pas toujours identiques, utiliser le même volume ne signifie pas la même quantité. Il est important que l’anticorps isotypique soit de même nature, couplé au même fluorophore et du même fournisseur que l’anticorps primaire spécifique.

Est-il possible de congeler les anticorps conjugués aux fluorophores ?
Il est déconseillé de congeler les anticorps couplés aux fluorophores car la congélation peut dénaturer les anticorps ou provoquer le découplage des fluorophores des anticorps durant le processus congélation / décongélation. De plus, les anticorps peuvent s’agglutiner et former des agrégats, entrainant ensuite leur liaison non spécifique aux cellules. Il est donc recommandé de conserver les anticorps conjugués à des fluorophores à 4°C et protégés de la lumière.