TECHOZYME
TOUT SAVOIR SUR LA PCR HAUTE-FIDÉLITÉ
La PCR haute-fidélité est essentielle pour les expériences exigeant des amplifications d’ADN sans mutation, comme le clonage, le séquençage (NGS), la mutagenèse…
Découvrez à travers ce TechOzyme, une mini-revue sur la PCR haute-fidélité incluant les différentes générations d’enzymes existantes et des conseils sur les bonnes pratiques pour mesurer la fidélité d’une ADN polymérase et comment comparer et choisir l’enzyme de PCR fidèle adaptée à vos applications. 
QUE SIGNIFIE UNE PCR FIDÈLE ?  
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La fidélité de la PCR est exprimée très souvent en taux d’erreur (ou taux de mutation) qui correspond à la fréquence de mutation (nucléotide(s) incorporé(s) erreur) par pair de base incorporée et par duplication. La fidélité de la PCR dépend essentiellement de l’ADN polymérase. Elle est également influencée par la composition du tampon de réaction comme par exemple les concentrations en magnésium et en dNTP, le pH, etc. (Cline et al, Nucleic Acids Research, 1996, Vol. 24, No. 18). Toutes les ADN polymérases peuvent incorporer des nucléotides inappropriés au cours d’une duplication, certaines peuvent les reconnaître, les enlever et les remplacer par les nucléotides corrects grâce à l’activité 3’ – 5’ exonucléase, également appelée l'activité de relecture (« proofeading »). La Taq ADN polymérase, n’ayant pas d’activité de relecture intrinsèque, introduit environ une erreur tous les 1 à 2 kilobases (kb). Les enzymes de PCR fidèle ont toutes une activité de relecture.
LES ADN POLYMERASES THERMOSTABLES FIDÈLES
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Les ADN polymérases seules :
Ces polymérases possèdent toutes une activité exonucléasique 3’-5’ intrinsèque. Elles sont environ 6 à 7 fois plus fidèles qu’une Taq ADN polymérase. L’une des premières polymérases fidèles découvertes utilisées provient du Pyroccus furiosus (Ex : Pfu ADN polymérase). Mais l’activité de relecture impacte la processivité de l’enzyme (cf. section ci-dessous « Le saviez-vous ? » sur la processivité). L’amplification de fragment d’ADN de grande taille et le rendement de la PCR sont alors compromis. Généralement, ces polymérases ne peuvent pas amplifier des fragments d’ADN au delà de 2 kb.
La « Technologie LA » et les mélanges d’enzymes :
La « technologie LA » (« Long & Accurate ») est une technologie brevetée qui consiste à mélanger une Taq ADN polymérase avec, en faible quantité, une ADN polymérase thermostable ayant une activité de relecture. L’activité de relecture de la deuxième enzyme confère la fidélité au mélange sans compromettre sa processivité. L’amplification des longs fragments d’ADN et le rendement de PCR sont alors améliorés. La fidélité des mélanges d’enzyme est d'environs 6 à 10 fois supérieure à la Taq. Plusieurs mélanges d'enzymes bénéficiant de cette technologie sont disponibles sur le marché. 
Les enzymes de PCR haute-fidélité de fusion :
Des ADN polymérases thermostables avec une activité de relecture accrue ont été découvertes et sélectionnées au cours des dernières décennies (par exemple les ADN polymérases « Pyroccocus like »). Fusionnées à un ou plusieurs cofacteurs telle qu'une protéine de fixation à l’ADN non spécifique d’une séquence (par exemple la Sso7d extrait du Sulfolobus solfataricu), elles sont au moins 50 fois plus fidèle qu'une Taq. Ce sont des enzymes de PCR haute-fidélité. De plus elles sont très processives dont la vitesse d’élongation et le rendement sont nettement supérieurs à une Taq. Par exemple, une ADN polymérase de fusion peut amplifier à une vitesse entre 5 sec à 15 sec/kb. La Fidelio® Hot Stat DNA Polymerase appartient à ces enzymes.
COMMENT DÉTERMINER LA FIDÉLITÉ D'UNE ADN POLYMÉRASE ?
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Méthode de détermination du taux d’erreur
Plusieurs méthodes sont décrites dans la littérature pour déterminer le taux d’erreur (fréquence de mutation/pb/duplication) d’une ADN polymérase 1,2. Nous pouvons les classer en deux catégories:
La méthode par phénotypage : le gène lacZa ou le gène lacI sont souvent utilisés. Ces gènes sont d’abord amplifiés par PCR avec l’ADN polymérase à tester,. Les produits de PCR sont ensuite clonés et transférés dans une souche d’E.coli compatible avec la sélection bleu/blanc. En incluant l'X-gal et l’IPTG dans le milieu de culture, la présence ou l'absence de mutations dans ces gènes dues aux erreurs d'amplification de l'ADN polymérase peuvent être identifiées grâce aux couleurs des colonies (bleues ou blanches) . Ce test est couramment appelé le test bleu-blanc dans les laboratoires. Mais il ne permet pas d'identifier les mutations dites « muettes » qui n'affectent pas les expressions des gènes.

La méthode par séquençage direct : c'est la méthode la plus fiable. La séquence d'un ADN préalablement sélectionné est amplifiée par PCR avec l’ADN polymérase à tester, puis les produits de PCR sont clonés et séquencés. Le taux d’erreur est exprimé en pourcentage du nombre de bases mutées sur le nombre total de bases séquencées.

Comment comparer la fidélité des enzymes ?
La fidélité des différentes enzymes est comparable uniquement si la même méthode, le même gène ou la même séquence d’ADN sont utilisés. En effet, la fidélité mesurée varie d’une méthode à l’autre et dépend de la composition de la séquence d’ADN. Il est impossible de comparer de manière pertinente la fidélité des enzymes de PCR provenant des fabricants divers. 
COMMENT CHOISIR VOTRE ENZYME HAUTE- FIDÉLITÉ  ?
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Il faut prendre en compte le besoin d'une expérience sur la fidélité, la longueur d’amplification et la complexité de la séquence d'ADN cible (le pourcentage en GC, les séquences répétées …) et vérifier si l'enzyme sélectionnée est bien adaptée. Par exemple, la Fidelio® Hot Start DNA Polymérase, une nouvelle génération d’enzyme de PCR Haute-Fidélité, est compatible avec la PCR longue-distance (jusqu’à 20 kb à partir d’ADN génomique humain), la PCR spécifique grâce à son activité de démarrage à chaud et la PCR riche en GC (ou difficile) grâce à son tampon GC. 
QUESTIONS FRÉQUEMMENT POSÉES
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Est-ce que les enzymes de PCR haute-fidélité peuvent incorporer des dUTP ?
Non, les enzymes de PCR haute-fidélité sont bloquées par le dUTP. Il est donc déconseillé d’utiliser des mélanges de dNTP incluant du dUTP. Il n’est pas conseillé non plus d’utiliser des dUTP avec les mélanges d’enzyme « long & accurate ». 

Peut-on utiliser des amorces incluant de l’inosine ?
Non, car l’ADN polymérase est stoppée par l’inosine. Il est recommandé dans ce cas de travailler avec des nucléotides dégénérés. Utilisez les nucléotides A, T, G ou C à la place de l’inosine.
 
Est-ce que les fragments d’ADN amplifiés par des enzymes de PCR fidèle sont compatibles avec le clonage type « TA Cloning » ?
Tout dépend de l’ADN polymérase fidèle utilisée :
•   Si c’est une ADN polymérase haute-fidélité seule ou fusionnée : les produits d’amplification générés ne sont pas compatibles avec le clonage TA, car ils ont des extrémités franches dépourvues de A sortants.
•   En revanche, les ADN amplifiés par un mélange d’enzyme (Taq ADN polymérase associée à une enzyme dotée d'activité exonucléasique 3’-5’) peuvent être clonés par les systèmes « TA Cloning ». Dans ce cas, il est recommandé de réaliser le clonage TA immédiatement après la PCR.
LE SAVIEZ-VOUS ?
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Que signifie la processivité d’une ADN polymérase ?
La processivité est la fréquence de fixation et de dissociation d’une ADN polymérase à sa matrice d’ADN au cours de la duplication. Plus la fréquence est élevée, moins la processivité de l’enzyme est importante.

Comment cloner par « TA-cloning » un produit de PCR avec des extrémités franches ?
Il est possible d’ajouter du dA aux fragments d’ADN avec des extrémités franches. Vous devez d’abord éliminer complètement l'ADN polymérase Haute-Fidélité (à l’aide d’un kit de purification de produits de PCR ou en réalisant une extraction au phénol/chloroforme suivie d’une précipitation à l’éthanol) puis ajouter la Taq ADN polymérase.
Veuillez-trouver ci-dessous le protocole que nous conseillons :
  1. Purification des produits de PCR : nous recommandons le  DNA Clean & Concentrator™ kit.
  2. Ajout du dA :  
  • Produit de PCR purifié de l'étape 1
  • dATP 0,2 mM
  • Tampon de réaction de la Taq 1x
  • Taq'Ozyme ADN polymérase 1 unité
  • Incubation à 72°C pendant 20 min.

La compatibilité des ADN polymérases avec les thermocycleurs dits « FAST » :
Toutes les enzymes de PCR ne sont pas compatibles avec les thermocycleurs dits « FAST » dont la vitesse de montée en température peut atteindre 5 °C/sec. Certaines polymérases ont été rapportées comme étant incompatibles avec des montées de température supérieures à 2 °C/sec. Notre enzyme de PCR haute-fidélité la Fidelio® Hot Start DNA Polymerase fonctionne parfaitement sur ce type de thermocycleur, par exemple avec nos thermocycleurs qui ont un temps de montée en température de 5 °C/sec.