TECHOZYME
QUANTIFICATION DES CYTOKINES
LES OUTILS POUR QUANTIFIER LES CYTOKINES
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La régulation du système immunitaire requiert de multiples interactions cellulaires qui s'effectuent par contact direct et par l'intermédiaire de médiateurs solubles : les cytokines. Les cytokines sont des molécules pléiotropes qui coordonnent la réponse immunitaire, l'inflammation, la fibrose et l'hématopoïèse. Elles régulent de multiples processus cellulaires comme l’activation, la migration, la prolifération ou encore l’apoptose. Elles sont impliquées dans la physiopathologie de nombreuses maladies humaines, telles que les maladies auto-immunes (polyarthrite rhumatoïde et le lupus), les maladies inflammatoires, infectieuses, allergiques et cancéreuses.
De part leur implication dans de multiples processus, elles constituent une cible thérapeutique essentielle et leur dosage est un axe de recherche.

Dans ce TechOzyme, nous présentons les différents types de dosages immunologiques permettant de quantifier les cytokines, leurs différents formats et avantages.
LES KITS ELISA
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L’ELISA ou « Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay » est la technique la plus utilisée pour détecter et doser aussi bien des cytokines solubles, des chimiokines, des facteurs de croissance, ou même certaines hormones présentes à de très faibles concentrations (du nanogramme au picogramme / ml) dans le plasma, le sérum, les surnageants de culture cellulaire ou d’autres fluides biologiques. Elle repose sur le principe de fixation spécifique d’un anticorps à un antigène. L’ELISA est un dosage immunologique hautement sensible et spécifique, fiable et reproductible.

Les différents types de kits ELISA

ELISA direct
Schéma d'un ELISA direct
L’antigène « coaté » sur une plaque multi-puits est détecté par un anticorps directement conjugué à une enzyme.
L’autre option (ou option inverse) moins courante est que l’anticorps est « coaté » sur la plaque et un antigène marqué est utilisé pour la détection.
Le principal avantage de ce kit est la rapidité.


ELISA indirect
Schéma d'un ELISA indirect
L’antigène est détecté en 2 étapes :
.   Capture : un anticorps primaire non marqué et spécifique de l’antigène est appliqué
.   Détection : un anticorps secondaire couplé à une enzyme est ensuite ajouté

Cette méthode a plusieurs avantages :
Meilleure sensibilité : amplification du signal par fixation de plusieurs anticorps secondaires à l’anticorps primaire
Réduction des coûts


ELISA dit « Sandwich » (cf. schéma)
Schéma d'un ELISA en  « Sandwich »
L’antigène-cible est lié à l’anticorps de capture « coaté » et à l’anticorps primaire de détection.
Si l’anticorps de détection est conjugué à une enzyme, on parle d’ELISA Sandwich direct. Si l’anticorps de détection n’est pas conjugué, un second anticorps de détection est alors nécessaire et on parle alors d’ELISA Sandwich indirect.


ELISA par compétition ou inhibition
Schéma d'un ELISA par compétition ou inhibition
C’est l’ELISA le plus complexe qui est utilisé pour mesurer la concentration d’un antigène dans un échantillon.
Dans ce cas, les échantillons sont ajoutés à une plaque ELISA contenant un antigène lié connu. Après « coating », blocage et lavages, les échantillons inconnus sont ajoutés à la plaque. La détection est ensuite réalisée de la même manière que pour les autres formats d’ELISA.
Si l’antigène dans l’échantillon est identique à celui adsorbé sur la plaque, alors il y aura une compétition pour l’anticorps de détection entre l’antigène lié et l’antigène libre. S’il y a une haute concentration d’antigène dans l’échantillon, alors le signal produit dans le test sera fortement réduit. Au contraire, s’il y a peu d’antigène dans l’échantillon, on observera une réduction minimale du signal. Pour résumer, la concentration d'antigène est mesurée en notant la réduction de signal. Si l’anticorps de détection est marqué, on parle d’ELISA par compétition direct. Dans le cas contraire, l’ELISA est dit par compétition indirecte.
Les ELISA par compétition ou inhibition peuvent être basés sur n’importe lequel des formats ELISA évoqués ci-dessus, direct, indirect ou en Sandwich. En conséquence, ils offrent :

.   Le maximum de flexibilité.
.   Souvent utilisés quand seul un anticorps est disponible pour l’antigène d’intérêt ou quand l’analyte est petit, dans ce cas il ne peut pas être lié par 2 anticorps différents.


Les résultats obtenus avec les kits ELISA

Les tests ELISA génèrent 3 types différents de données :

  Quantitatives : les données ELISA peuvent être interprétées en comparaison avec une courbe standard (des dilutions en série d’un antigène donné purifié) pour calculer précisément les concentrations de l’antigène dans divers échantillons

  Qualitatives : les tests ELISA peuvent aussi être utilisés pour obtenir une réponse OUI/NON indiquant si un antigène particulier est présent dans un échantillon, en comparaison avec un puits blanc ne contenant pas d’antigène ou un antigène de contrôle sans rapport

  Semi-quantitatives : il est possible de comparer les taux relatifs d’un antigène dans des échantillons, puisque l’intensité du signal est directement corrélée à la concentration de l’antigène
Les formats des ELISA dits en « Sandwich »

  Les kits complets et prêts à l’emploi : ces kits contiennent des plaques « pré-coatées » avec l’anticorps de capture et l’ensemble des réactifs (tampons)
    nécessaires à la réalisation de l’ELISA. Validés avec différents échantillons biologiques et reproductibles au sein d’un même test ou même d’un test à l’autre.

Comment choisir son kit ELISA dit en « Sandwich » ?
Outre l’espèce étudiée (homme, souris ou rat), 3 paramètres rentrent également en compte : le temps, le niveau de familiarisation avec la technologie ELISA et le budget pouvant être alloué.
Les avantages des ELISA dits en « Sandwich »

.   Une haute spécificité car 2 anticorps sont utilisés pour capturer et détecter spécifiquement l’antigène / analyte
.   Appropriés pour les échantillons complexes, puisque l’antigène ne nécessite aucune purification avant le dosage
.   Une haute flexibilité et sensibilité car à la fois les méthodes de détection directe et indirecte peuvent être utilisées
LES DOSAGES IMMUNOLOGIQUES EN MULTIPLEX BASÉS SUR L’UTILISATION DE BILLES
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Descriptif
Ils sont basés à la fois sur la capacité d’un cytomètre à détecter finement différents niveaux de fluorescence, et sur l’utilisation de billes couplées à des anticorps qui capturent spécifiquement différents analytes (=cytokines). Chaque bille du dosage possède une intensité de fluorescence unique, ce qui permet de mélanger et d’enregistrer différentes billes en même temps dans un seul tube. A la différence des ELISA qui permettent de quantifier une seule cytokine à la fois, ces dosages en multiplex peuvent quantifier de multiples cytokines simultanément à partir d’un même échantillon. Le multiplexage est aussi particulièrement utile quand la quantité d’échantillon est faible, en augmentant le nombre de protéines qui peuvent être analysées. Chaque essai est composé d’une paire d’anticorps qui est évaluée pour sa gamme dynamique et sa sensibilité. Les anticorps de détection sont directement marqués à la phycoérythrine (PE). La méthode de détection streptavidin-biotin-PE n’est pas utilisée dans ce type de dosage ce qui permet de minimiser le bruit de fond souvent généré par la biotine endogène dans les échantillons.

QUESTIONS FRÉQUEMMENT POSÉES
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Quelle est la sensibilité des kits ELISA ?
L’ELISA est un test immunologique particulièrement sensible. La gamme de détection typique est de l’ordre de 0,1 à 1 fmole ou de 0.01 ng à 0,1 ng avec une sensibilité dépendant des caractéristiques particulières de l’interaction anticorps-antigène. De plus, quelques substrats comme ceux donnant un signal fluorescent ou un signal chimioluminescent peuvent accroître cette sensibilité. Comme mentionné plus haut, la détection indirecte produira des taux plus élevés de signal et peut être plus sensible. Cependant, elle peut aussi générer plus de bruit de fond et réduire les niveaux de signal spécifiques.

Pourquoi les concentrations en cytokines dans mon échantillon obtenues avec le kit LEGEND MAX™ de BioLegend sont-elles différentes de celles obtenues avec d’autres kits ELISA ?
Actuellement, il est très difficile d’obtenir exactement les mêmes concentrations de cytokines (au niveau pg/ml) dans son échantillon, quand on compare les valeurs obtenues avec des kits différents pour plusieurs raisons :
.   L’immunoréactivité des réactifs varient selon les fabricants
.   Dans le domaine de la quantification des cytokines particulièrement pour les cytokines de l’ordre du pg/ml, le plus pertinent est de voir l’effet d’un traitement
    plutôt que de mesurer une concentration absolue. Ainsi, une même cytokine mesurée par différents kits devrait donner le même profil d’expression.

Il est critique que les kits ELISA d’un même fabricant donnent des résultats reproductibles d’un lot à l’autre pour une même cytokine dosée.
Faut-il utiliser du serum ou du plasma en échantillon ?
Tout dépend de la cible à détecter. En fonction des cibles étudiées, il peut y avoir une différence de concentration de celles-ci entre le serum et le plasma. Le facteur le plus important dans la préparation des échantillons de plasma ou de serum est sa qualité pour assurer des mesures précises. En général, les échantillons de plasma/serum doivent être exempts de particules et ne doivent pas contenir de lipides en excès. Ce type de contaminants contribue en effet au bruit de fond et affecte la précision du test. La clé pour préparer des échantillons de qualité repose sur les étapes suivantes : centrifuger les échantillons à la même vitesse et pendant le même temps, éliminer le sérum ou le plasma immédiatement après la centrifugation, aliquoter et congeler les échantillons au même moment. Eviter les cycles répétés de congélation-décongélation.

Est-il possible d’utiliser des échantillons de tissus ?
La plupart des kits ELISA notamment ceux de BioLegend peuvent être utilisés avec des extraits ou homogénats de tissus/cellules tant que les échantillons sont préparés selon un protocole qui respecte leur réactivité immune :
.   Les tissus/cellules doivent être lysés ou homogénéisés dans un tampon de pH neutre qui ne contient pas de produits chimiques dénaturants comme l’urée, le thiourée ou le SDS.
.   Éviter les détergents (SDS, Triton X-100…)
.   Éviter l’excès de force ionique (concentration en sel supérieure à la force ionique physiologique)
.   Les tampons doivent contenir suffisamment d’inhibiteurs de protéases pour préserver les protéines cibles de la dégradation protéolytique par des enzymes
    libérées par les cellules
ASTUCES D'OPTIMISATION
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Comment obtenir un meilleur signal et une meilleure sensibilité ?
Pour augmenter l’intensité du signal et la sensibilité, les temps d’incubation doivent être allongés. Il est également recommandé d’agiter les plaques durant les étapes d’incubation. Il faut s’assurer que le standard est complètement reconstitué avant utilisation.

Mon échantillon renferme de très faibles taux d’analyte. Quelles méthodes utiliser pour améliorer la détection ?
.   Contrôler le bruit de fond : en augmentant le nombre de lavages et en réduisant le temps entre chaque lavage
.   Contrôler la précision du test : en s’appliquant lors des pipettages et en augmentant les volumes de lavage
.   Augmenter les temps d’incubation : attention toutefois car cela peut accentuer le bruit de fond et, la sensibilité du test n’est pas forcément meilleure
.   Concentrer l’échantillon si possible