TECHOZYME
OPTIMISEZ LE RAPPORT SIGNAL/BRUIT DE FOND EN IMMUNOFLUOESCENCE
L’immunofluorescence est une technique sensible permettant de détecter plusieurs cibles simultanément :
Soit avec plusieurs anticorps  dirigés contre des cibles différentes
Ou bien, avec un seul anticorps spécifique et un ou plusieurs systèmes de marquage tels que des colorants ou des bio-conjugués (ex : co-localisation des organites).
Il convient de réaliser une succession d’étapes optimales pour obtenir un marquage sensible, et spécifique et éviter un bruit de fond important.
Il convient également de bien choisir le type de marquage selon  l’abondance de la cible pour obtenir un niveau de signal suffisant. Certaines cibles peuvent être indétectables si le niveau d’amplification utilisé n’est pas adapté, bien que présentes et reconnues spécifiquement par un anticorps. La maîtrise du niveau de bruit de fond passe par une étape de blocage adaptée à la technique utilisée et par une élimination de l’auto-fluorescence.

Nous détaillerons dans ce TechOzyme les étapes pour optimiser le signal en IF.
GÉNÉRALITÉS
LES TYPES D’ÉCHANTILLONS
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L’immunofluorescence peut être réalisée sur des types d’échantillons variés :
.   Des coupes de tissus inclus en paraffine (nécessaire de déparaffiner et faire un démasquage de l’antigène)
.   Des coupes de tissus congelés
.   Des cellules en culture (immuno-cytochimie)

Différentes étapes particulières seront ajoutées ou retirées avant le marquage lui-même selon la nature de l’échantillon :
  Déparaffinage/réhydratation (xylène et éthanol) et démasquage de l’antigène (tampon citrate ou EDTA selon l’anticorps), se référer à la fiche technique de
    l’anticorps pour les coupes de tissu en paraffine

.   Création d’une barrière hydrophobe autour des coupes de tissus avec un stylo spécifique pour retenir sur l’échantillon les différents réactifs (PAP PEN réfs.

.   Traitement particulier des cellules en culture pour éviter le bruit de fond de fluorescence vert couramment observé et causé par le Phénol Red (indicateur de pH)
     contenu dans les milieux de cultures classiques (voir le paragraphe sur l’auto-fluorescence).

LES ÉTAPES DU PROTOCOLE : LE WORKFLOW
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Les échantillons sont fixés, perméabilisés et bloqués avant le marquage par l’anticorps.
.   La fixation a pour but de préserver les structures à observer en permettant le marquage et la conservation des échantillons
.   La perméabilisation permet aux anticorps de rentrer à l’intérieur des cellules pour accéder à leurs antigènes
.   Le blocage évite une fixation aspécifique des anticorps notamment des anticorps secondaires sur toute la surface de l’échantillon (voir le paragraphe sur le
    blocage)
.   Ensuite, l’immuno-marquage est réalisé à l’aide d’un ou de plusieurs anticorps, de manière séquentielle ou simultanées ; en marquage direct ou indirect (voir le
    paragraphe sur la stratégie à adopter)

Il existe de nombreux protocoles pour ces étapes mais aucun n’est universel. Il est recommandé de suivre les données fournies par le fournisseur sur la fiche technique, sachant que les conditions optimales varient énormément d’une cible à l’autre. Dans le cas de Cell Signaling Technology, les anticorps sont validés en interne. Un protocole détaillé est fourni pour chaque anticorps et les points importants sont précisés sur la fiche technique (dilution, conditions particulières de perméabilisation et/ou fixation).
Comment trouver ces informations
sur la fiche technique ?

Le montage est la dernière étape avant l’observation et peut inclure une étape de contre marquage.
Les milieux de montage entre lame et lamelles, liquides ou solides, permettent la visualisation au microscope des préparations et la conservation des lames. Le vernis à ongles habituellement utilisé sert à sceller le bord de la lamelle dans le cas de milieu de montage liquide pour éviter la déshydratation. Pour l'IF, on utilise des milieux de montage ayant en plus la capacité de conserver la fluorescence (effet anti-photobleaching). Il faut vérifier aussi que le milieu de montage est adapté aux fluorophores utilisés. En effet, la présence de solvant dans certains milieux de montage les rend incompatibles avec les fluorophores.

En général, les milieux de montage qui restent liquides permettent une observation immédiate. Au contraire les milieux de montage qui solidifient, nécessitent une étape supplémentaire de séchage–solidification.
Tous les milieux de montage existent avec ou sans intercalant, comme le DAPI pour faire un contre marquage simultané du noyau.



Optimisez le rapport signal/bruit de fond
OPTIMISEZ LE RAPPORT SIGNAL/BRUIT DE FOND
LE NIVEAU DE SIGNAL : STRATÉGIE DE MARQUAGE EN FONCTION DE L’ABONDANCE DE LA CIBLE
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Il est très important avant de choisir un protocole (direct ou indirect / avec ou sans amplification) de connaître précisément son échantillon et plus particulièrement, l’abondance de la protéine à détecter pour déterminer le type de détection à utiliser.

Le marquage direct utilise un seul anticorps primaire directement conjugué pour détecter une protéine d’intérêt. Ce type de marquage implique de disposer d’un primaire conjugué au fluorophore de son choix ou de le conjuguer soi-même. Il n’y a pas d’amplification du signal.

Le marquage indirect utilise au moins deux anticorps :
.   Un primaire spécifique de la protéine d’intérêt
  Un secondaire, reconnaissant le primaire, conjugué à un fluorophore ou à la biotine. Dans le cas d’une conjugaison à la biotine, on utilise un troisième anticorps anti-biotine conjugué directement à un fluorophore ou à la streptavidine, elle-même conjuguée à un fluorophore. Un système supplémentaire d’amplification peut aussi être utilisé (ex : tyramide).

On attend entre un marquage direct (primaire directement conjugué à un fluorophore) et un marquage indirect (primaire non conjugué + secondaire conjugué à un fluorophore) une amplification du signal de l’ordre de 3.
Il est aussi possible d’utiliser un primaire biotinylé avec une streptavidine pour amplifier un signal faible. Dans ce cas, cela nécessite une étape de blocage supplémentaire (voir le paragraphe sur les blocages).

La technique d’amplification du signal par la tyramide utilise l’enzyme HRP (horseradish peroxidase) pour générer un marquage haute-densité. Cette technique s’utilise en marquage indirect avec :
.   un primaire non conjugué
.   un secondaire-HRP.
.   une incubation avec la tyramide conjugué à un fluorophore (ici les CF™ Dyes)
    L'enzyme HRP catalyse la fixation de la tyramide aux tyrosines adjacentes. Les fluorophores sont détectés directement.
.   ou une incubation avec la tyramide conjugué à la biotine, suivie d’une streptavidine conjuguée à un CF™ Dye pour encore amplifier le niveau de signal.
    L’amplification par la tyramide permet une augmentation de la sensibilité d’au moins 50 fois par rapport à une détection indirecte classique (primaire +
    secondaire conjugué).

LE BRUIT DE FOND
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LE BLOCAGE
Il existe plusieurs types de blocage en IF, à choisir en fonction de la stratégie de marquage (direct, indirect) et du choix des réactifs. Il n’y a donc pas de protocole universel.

Types de blocage que l’on peut envisager :
- Blocage de la biotine endogène :
S’utilise pour bloquer la biotine endogène naturellement présente dans certaines cellules, tissus ou organes (ex. reins, foie et cerveau, ..) dans le cas d'une étape d’amplification en IF indirecte par le couple biotine-streptavidine (voir la définition de marquage directe ou indirecte au paragraphe stratégie de marquage).
Pour éliminer la biotine endogène libre, un excès de streptavidine non marquée est ajouté sur l’échantillon pour se  fixer aux biotines endogènes. Ensuite la streptavidine (tétramérique) est bloquée avec un excès de biotine non marquée. Le blocage de la biotine endogène est réalisé avant le blocage par le sérum.


- Blocage des récepteurs Fc :
Certains types cellulaires ou organes (ex. monocytes, macrophages, lymphocytes B, thymus ou rate,…) ont beaucoup de récepteurs Fc à leur surface. Ceux-ci réagissent avec les immunoglobulines de souris ou de lapin et génèrent un marquage aspécifique. Ces récepteurs peuvent être bloqués par une incubation avec des immunoglobulines provenant de l’espèce des cellules étudiées avant l’immuno-marquage. Une autre solution consiste à utiliser des anticorps secondaires IgG F(ab)'2 purifiés par affinité pour éviter la fixation de la partie Fc aux récepteurs Fc des cellules vivantes.

Liste des anticorps secondaires IgG F(ab)’2, conjugués à la biotine, aux CF™ Dyes ou avec des Alexa Fluor™ Contactez notre support scientifique


- Blocage « classique » des protéines : consiste à ajouter une protéine ou un mélange de protéines qui empêche la fixation aspécifique des IgG sur les cellules ou tissus.
Les réactifs bloquant « universels » sont la BSA, le lait en poudre, la gélatine de poisson, ou le sérum normal de chèvre ou d’autres espèces. En IF, on privilégie plutôt la gélatine ou les sérums.
La BSA ou le lait peuvent contenir des IgG de bovin potentiellement reconnaissables par les anticorps secondaires anti-chèvre ou mouton, ces 2 espèces sont assez proches des bovins. De même, on n’utilisera pas un sérum de la même espèce d’origine que le primaire pour éviter que le secondaire ne se fixe aux protéines du sérum en même temps que le primaire.
La règle est donc de toujours choisir un sérum normal venant de la même espèce que le secondaire utilisé. Par exemple, utiliser un sérum de chèvre normal (noté NGS pour Normal Goat Serum) avec un anticorps secondaire anti-souris ou anti-lapin fait chez la chèvre.
Liste des sérums normaux disponibles pour le blocage  Contactez notre support scientifique


L'AUTOFLUORESCENCE :  LES CAUSES & LES REMEDES
Il y a plusieurs causes à l’auto-fluorescence dans les cellules mammifères :

- Les milieux de culture des cellules
Une des causes peut être pour les cellules en culture l’utilisation de milieux contenant du Phénol Red. En effet, les colorants de toute sorte peuvent émettre de la fluorescence. Il est donc recommandé de laver ses cellules avant l’expérience en PBS, mais l’idéal est de les cultiver en milieu dépourvu de Phénol Red.
Il existe aussi pour éliminer l’auto-fluorescence verte liée au milieu de culture un « quencher » de fluorescence qui permet facilement de réduire notablement ce bruit de fond : c’est le BackDrop ®Green Background Suppressor (ref 12388)

- L’étape de fixation
L’auto-fluorescence dans les cellules mammifères est due aux flavines (coenzymes), aux pyridines des nucléotides, et au collagène ; elle est souvent aggravée par le stress de la cellule et la mortalité.
Ce sont les techniques de fixation qui ont tendance à amplifier l’auto-fluorescence. En effet la fixation par les aldéhydes et particulièrement le glutaraldéhyde donne un niveau d’auto-fluorescence élevé. On retrouve cette auto-fluorescence plutôt dans les tissus inclus en paraffine.
Le blocage des aldéhydes libres avec de la glycine, NaBH4 ou NH4Cl est alors utile.
Il est possible de rajouter de la glycine à 100 mM final dans le tampon de blocage ou de faire un lavage en PBS +0,1% NaBH4.

- L’accumulation de lipofuscine
Dans les tissus mammifères, on retrouve ce pigment fluorescent qui s’accumule dans le cytoplasme des cellules des tissus âgés.
QUESTIONS FRÉQUEMMENT POSÉES
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Pourquoi les anticorps primaires validés en WB ne fonctionnent-ils pas systématiquement en IF ?
En IF, un anticorps primaire doit reconnaitre la forme native non dénaturée de l’antigène. En WB, l’anticorps reconnait la forme dénaturée de l’antigène.
C’est pourquoi  la validation des anticorps pour l’IF exige de tests plus poussés pour vérifier la sensibilité et la spécificité.

Comment vérifier la spécificité du marquage obtenu ?
Il est préférable d’utiliser une autre technique (Western blot) pour vérifier que son tissu ou ses cellules expriment bien la protéine ciblée dans les conditions utilisées (induction, répression …). Cela permettra d’évaluer son niveau d’expression et donc de choisir le système de détection adapté (marquage direct, indirect, indirect amplifié…) (voir paragraphe sur le choix du système de marquage).
L’idéal comme dans toute expérience est d’avoir :
.   Des contrôles positifs : tissus ou cellules où l'antigène cible est exprimé dans des quantités permettant le marquage
.   Des contrôles négatifs : tissus ou cellules dans des conditions ou la protéine est éteinte, ou porteuse de mutations.

Les contrôles positifs idéaux figurent sur les fiches techniques des anticorps.
Les contrôles négatifs permettent de vérifier l’absence de bruit de fond de fluorescence ou de marquage non spécifique du primaire ou du secondaire.

Comment réaliser un multi-marquage ?
Réaliser un multi-marquage demande de nombreuses optimisations de protocole pour choisir les bons réactifs et un protocole adapté (marquage direct ou indirect, simultané ou séquentiel).
Comment savoir si mes tissus contiennent de la biotine endogène ?
Il suffit d’incuber directement l’échantillon avec de la streptavidine conjuguée à un fluorophore ou un anticorps anti-biotine conjugué. Si on observe un signal, les tissus contiennent de la biotine endogène. Une étape de blocage de la biotine est alors nécessaire.
ASTUCES D'OPTIMISATION : CHOIX DES FLUOROPHORES
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Il est important de choisir de manière judicieuse sa combinaison de fluorophores en fonction :
.   Des filtres disponibles sur son microscope et consulter les spectres d’absorption/émission de fluorescence
.   Utiliser préférentiellement des fluorophores avec des spectres d’émission étroits et non chevauchants pour s’assurer de la spécificité du signal observé
.   Sélectionner le fluorophore en fonction de l'abondance de la cible. Exemple : prendre le plus brillant pour la cible la moins abondante
.   Choisir des fluorophores stables (peu de photobleaching) et stabiliser la fluorescence avec un milieu de montage adapté au fluorophore choisi (voir paragraphe
    montage)


Ozyme propose une large gamme d’anticorps secondaires conjugués aux CF™ Dyes qui sont particulièrement stables et brillants. Il existe également des kits de conjugaisons Mix-N-Stain pour conjuguer vos anticorps au CF™ Dyes. Les CF™ Dyes sont particulièrement recommandés en IF pour leur brillance et leur résistance au photobleaching, notamment en alternative aux Alexa Fluor®.