TECHOZYME
COMMENT OPTIMISER VOS EXPÉRIENCES D'IMMUNOFLUORESCENCE EN MULTI-MARQUAGE
L’immunofluorescence est une technique sensible permettant de détecter plusieurs cibles simultanément :
.   Soit avec plusieurs anticorps  dirigés contre des cibles différentes
.   Ou bien, avec un seul anticorps spécifique et un ou plusieurs systèmes de marquage tels que des colorants ou des bio-conjugués (ex : co-localisation des
    organites).

Tout l’intérêt de cette technique est de pouvoir faire du multi-marquage notamment par rapport à l’immunohistochime sur coupes de tissus.

Comme nous l’avons vu dans le TechOzyme immunofluorescence la multiplication des cibles à détecter, qui peut être très hétérogène en terme d’abondance respective, oblige à ajuster la stratégie de marquage. De même la coexistence de plusieurs stratégies de marquage (une par cible) sur un même échantillon conduit à choisir le protocole en fonction des réactifs sélectionnés, pour minimiser le bruit de fond du à des réactions croisées entre les anticorps utilisés. Par exemple, utiliser de 2 anticorps primaires issus de la même espèce complique la réalisation d’un double marquage.

Nous détaillerons dans ce Techozyme les étapes pour optimiser vos expériences de multi-marquage en IF.
LA CO-LOCALISATION EN IF
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Pour co-localiser sa protéine d’intérêt en IF, il est intéressant d’utiliser un marqueur d’organelle en parallèle d’un anticorps spécifique dirigé contre la protéine elle-même. Il en existe 3 types :
- Des anticorps conjugués qui reconnaissent spécifiquement une protéine exprimée dans une structure particulière (ex : synapse) ou dans une organelle (mitochondrie, golgi…). Cette option revient à faire du multi-marquage.

Vu la difficulté d’optimisation des protocoles de multi-marquage, il est judicieux de contourner le problème en utilisant un colorant ou un bio-conjugué :

- Des colorants fluorescents spécifiques de certaines molécules, comme par exemple :
.   Les intercalants de l’ADN : le DAPI, les HOECHST, l’iodure de propidium, le DRAQ5®, les RedDot™…

- Des bio-conjugués conjugués à des fluorophores : ce sont des biomolécules qui ont une affinité particulière pour une molécule localisée spécifiquement dans un organite et permettant de marquer l’organite ou la structure en question, quelques exemples :
.   Les lectines (concanavaline A et agglutinine de germe de blé) : qui ont une affinité pour les mono et oligosaccharides des glycoprotéines de surface cellulaire
.   L’alpha-bungarotoxine : qui est un antagoniste du récepteur de l’acétylcholine, est issue de venin de serpent, et marque les jonctions neuromusculaires
.   La phalloïdine : toxine du champignon amanite phalloïde qui se fixe à la F-actine du cytosquelette
.   La sous-unité B de la toxine cholérique : qui se fixe aux gangliosides GM1 des radicaux lipidiques de la surface cellulaire des cellules mammifères et, est utilisé comme marqueur d’endocytose ou marqueur neuronal

OPTIMISATION DU BRUIT DE FOND LIÉ AUX « REACTIONS CROISÉES » EN IF
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Le bruit de fond observé en IF est souvent issuede réactions croisées des anticorps utilisés.
Une « réaction croisée » est une réaction obtenue entre un anticorps dirigé contre une espèce envers une autre espèce proche génétiquement. Par exemple, entre bovin/ovin et bovin/caprin.
Une solution contre les réactions croisées entre espèces peut être la cross-adsorption, qui est une déplétion en certaines IgG capables de réagir contre d’autres espèces très proches.

La source du bruit de fond est souvent due à :
- la présence d'immunoglobulines dans le tissu étudié : on l'élimine en utilisant des anticorps secondaires purifiés par affinité et cross-adsorbés contre l'espèce du tissu étudié ou multi-cross-adsorbés contre plusieurs espèces proches.

- les anticorps primaires : il est recommandé d’utiliser des anticorps secondaires cross-adsorbés contre toutes les espèces source des anticorps primaires utilisés dans le marquage et conjugués avec différents fluorophores permettant le mutiplexage.
Les anticorps cross-adsorbés contre d’autres espèces peuvent être notés de la manière suivante : « min x w/human, mouse and rabbit IgG/serum proteins » ce qui signifie qu'ils ont été cross-adsorbés contre des IgG ou des protéines du sérum humain, souris et lapin. Ces anticorps permettent de travailler sur une coupe de tissu humain avec un primaire de souris et un primaire de lapin.

Il existe aussi des anticorps secondaires IgG F(ab)'2 et cross-adsorbés pour éviter la fixation de la partie Fc aux récepteurs Fc et faciliter le multiplexage.
Attention, il peut arriver que des anticorps cross-adsorbés contre des espèces proches de l’espèce cible aient plus de difficultés à reconnaitre un épitope et peuvent reconnaitre très faiblement des primaires monoclonaux. Il est donc préférable d’utiliser des anticorps cross-adsorbés uniquement dans des cas où cela se justifie. Par exemple, utiliser des secondaires de souris cross-adsorbés contre les IgG de rat seulement pour détecter des primaires de souris utilisé sur des tissus de rat contenant des immunoglobulines de rat endogènes.

Liste des anticorps IgG F(ab)’2 cross-adsorbés conjugués avec des Alexa Fluor™ : Contacter notre support technique

Pour minimiser le bruit de fond, il convient d’utiliser ses anticorps primaires à la dilution indiquée sur la fiche technique (voir détails de la fiche technique). S’il n’y a pas de dilution recommandée, il est préférable lors de la première utilisation de titrer l’anticorps pour savoir quelle dilution donne le meilleur rapport signal/bruit de fond. Il ne faut pas oublier que l’optimisation du rapport signal/bruit de fond passe aussi par l’optimisation du niveau de signal en adoptant la stratégie de marquage correspondant à l’abondance de la cible (voir le paragraphe « Stratégie de marquage en fonction de l’abondance de la cible »).
DANS QUEL ORDRE DOIT-ON RÉALISER LES ÉTAPES D’UN MULTI-MARQUAGE ? DOIT-ON UTILISER UN PROTOCOLE
SIMULTANÉ OU SÉQUENTIEL ?
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Quand utiliser un protocole simultané ?

Dans un protocole simultané, les étapes des différents marquages sont communes : l’échantillon est marqué par un mélange des anticorps primaire, puis par un mélange des anticorps secondaires.
En général pour les multi-marquages, les secondaires doivent être issus de la même espèce.

Un protocole simultané n’est possible que dans certains cas très précis, et doit permettre d’éviter les réactions croisées :

.   Protocole indirect : à utiliser si on dispose de deux anticorps primaires d’espèces différentes (suffisamment éloignées phylo-génétiquement comme le lapin et la souris (le rat et la souris sont trop proches). Les secondaires sont ici de même espèce source pour pouvoir être utilisés simultanément. On utilise idéalement des secondaires cross-adsorbés contre les espèces de l’échantillon étudié et des 2 primaires (voir plus haut). Cette solution est impossible si des sources d’anticorps spécifiques différentes ne sont pas disponibles commercialement. Cell Signaling Technology propose au catalogue un large panel d’anticorps monoclonaux de  souris et de lapin qui facilitent ce type de marquage. Dans le cas de cibles peu abondantes, on pourra aussi réaliser un marquage indirect permettant une amplification à l’aide d’anticorps primaires d’espèces identiques, mais d’isotypes différents accompagnés de secondaires spécifiques d’isotypes (voir explications plus loin).

.   Protocole direct : la solution la plus simple est de réaliser un double marquage direct avec des anticorps primaires conjugués de source identique, phylo-
    génétiquement proche ou différent permettant une incubation simultanée. Cette dernière solution est impossible si l’une des protéines ciblées est en quantité
    trop faible et que le signal nécessite une étape d’amplification (voir plus haut).
Quand utiliser un protocole séquentiel ?

En dehors des cas cités précédemment, on devra utiliser un protocole séquentiel plus compliqué et plus risqué en terme de bruit de fond car il multiplie les étapes.
Dans ce cas, on réalise un marquage complet (blocage, incubation du primaire, lavage, incubation du secondaire, lavage) contre une cible et ensuite on réalise le second. Un exemple courant de protocole séquentiel est l’utilisation de 2 primaires et 2 secondaires d’espèces différentes.
C’est aussi le cas pour un protocole indirect utilisant des anticorps primaires de même espèce et même isotype et 2 secondaires d’espèce source identique et de marquage différent.
Dans le cas de multi-marquage séquentiel avec deux primaires de même espèce, un blocage avec un second sérum permet de s’assurer que le premier secondaire est saturé (pour qu’il ne fixe pas le 2ème primaire lors de la suite du protocole). On choisit alors un sérum de l’espèce source des 2 primaires. En effet les secondaires habituels IgG(H+L) ou les F(ab’)2 sont divalents et donc après une première étape de marquage, on ne peut pas être sur que le second site de fixation du secondaire soit aussi saturé.
Représentation de la structure d'anticorps IgG
Pour être certain d’éviter ce problème, on peut utiliser 2 anticorps primaires d’une même espèce, mais de classe ou sous-classe différente avec des secondaires spécifiques des sous-classes.
Par exemple, prendre un primaire de souris monoclonal de sous-classe IgG2a et un autre primaire de souris monoclonal IgG1 à révéler avec des secondaires anti-souris reconnaissant spécifiquement la sous-classe IgG1 ou IgG2a.
Quand cette distinction entre 2 primaires d’une même espèce ne peut pas être faite par la classe (IgG, IgM…) ou la sous-classe (IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG2c, IgG3) comme pour les IgG de lapin, alors une autre stratégie peut être utilisée : les anticorps secondaires monovalents Fab.
Si on remplace le premier secondaire utilisé par un Fab, la question ne se pose plus. Alors un second secondaire divalent peut être utilisé pour le second primaire.
Liste des secondaires anti sous-classe de souris IgG1, IgG2 a ou b : Contacter notre support technique


Protocole séquentiel pour marquage mixte (direct et indirect)

Quand on cible une protéine abondante et une protéine moins abondante, on peut utiliser un protocole direct pour une des cibles (la plus abondante) et indirect pour l’autre (la moins abondante). On utilise dans ce cas un protocole séquentiel plus long. Il est désormais assez simple de conjuguer soit même un de ses anticorps primaire avec un fluorophore ou avec la biotine grâce aux kits Mix-n-Stain™(rendement de conjugaison covalente proche de 100% et rapide en 1 h)
Dans ce cas particulier, un protocole séquentiel devra être utilisé.
Dans le cas d’un double marquage indirect avec deux anticorps primaires d’espèces différentes, selon si l’on dispose de secondaires de source différente ou non, l’on pourra réaliser un protocole séquentiel ou simultané.
Un protocole séquentiel devient indispensable si l’on utilise une amplification par la biotine ou par la tyramine (voir explication au paragraphe stratégies de marquage).
QUESTIONS FRÉQUEMMENT POSÉES
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Y-a-t-il des contrôles à privilégier en cas de multi-marquage ?
En dehors des contrôles habituels en IF ( voir la question fréquemment posée : « Quels contrôles utiliser pour vérifier la spécificité du marquage obtenu ? » du précédent Techozyme sur l’IF ), un contrôle négatif couramment utilisé pour le multi-marquage et facilement disponible est un isotype contrôle de l’anticorps conjugué utilisé (comme en cytométrie en flux). Il doit être conjugué au même fluorophore, avoir subi la même purification (cross-adsorption par exemple) et être utilisé à la même concentration que le primaire ou le secondaire conjugué. L’utilisation d’un isotype contrôle est indispensable pour des cellules ayant des récepteurs Fc. On devra faire un contrôle isotypique par anticorps conjugué utilisé dans son multi-marquage.
Avant tout multi-marquage, vérifier que chaque anticorps est capable de réaliser individuellement un marquage sensible et spécifique.


Comment connaître la concentration de l’anticorps utilisé pour faire un contrôle avec un isotype contrôle en IF ?
.   Pour un anticorps Cell Signaling Technology (CST) : pour chaque nouveau lot, la concentration de ses anticorps est ajustée sur l’activité, garantissant les
    résultats pour les applications validées (WB, IHC, IF, …). Cela assure des résultats reproductibles d’un lot à l’autre sans modifier votre protocole. Si vous
    souhaitez connaître la concentration de votre anticorps CST, contactez notre service technique

.   Pour un anticorps Biotium : la concentration est identique pour chaque lot et figure sur la fiche technique du produit et est incluse en ligne dans la désignation
   de l’anticorps.