TECHOZYME
QUELS SONT LES POINTS-CLÉS POUR REUSSIR UNE PCR MULTIPLEXE
Vidéo expliquant les bonnes pratiques pour la PCR multiplexe
INTRODUCTION
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La PCR multiplexe est l’un des outils les plus utilisés en génotypage pour la détection des SNP, SSR, STR, microsatellites…, également employée pour identifier des pathogènes, des mutations, des maladies génétiques. C’est une approche plus économique que la PCR en simplexe, car elle nécessite moins de réactifs, d’échantillons et de temps.
Le principe de la PCR multiplexe est simple : on utilise un set de plusieurs couples d’amorces pour amplifier simultanément plusieurs cibles d’ADN en une seule réaction de PCR, plutôt qu’un seul couple d’amorces pour amplifier une cible d’ADN unique. En pratique, il n’est pas si simple de mener à bien une PCR multiplexe. La mise au point est souvent fastidieuse, car lorsque le nombre de cibles à amplifier dans une même réaction augmente, le niveau de complexité s’accroît. Des optimisations sont généralement nécessaires avant de bénéficier pleinement des avantages de la PCR multiplexe.
COMMENT PRÉPARER UNE EXPÉRIENCE DE PCR MULTIPLEXE ?
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Avant de réaliser votre PCR multiplexe, vous devez indiquer les séquences d’ADN cibles à amplifier dans une base de données telle que GenBank, puis faire le design des amorces spécifiques et vérifier leur compatibilité pour être mélangées ensemble dans une même réaction de PCR.
Schéma montrant les étapes pour concevoir les amorces de PCR
Ce qu’il faut vérifier pour le design des amorces :
Une fois les séquences cibles sélectionnées, vous pouvez faire le design des amorces spécifiques. Le choix des amorces est primordial pour réussir la PCR multiplexe. Les règles appliquées au design des amorces pour la PCR simple sont à respecter dans le cas de la PCR multiplexe. Citons les plus importantes ci-dessous :
La taille des amorces est souvent plus longue : entre 22 et 25 nucléotides
Le pourcentage de GC des amorces doit être idéalement compris entre 40 – 60 %
Il est recommandé d’éviter les répétitions en GC en 3’ de chaque amorce
Des logiciels en ligne comme PrimerPlex et Prime3 Plus (disponibles en accès libre) sont des outils appropriés pour le design des amorces.

Vérifier la compatibilité des amorces entres elles :
Une fois les séquences d’amorces définies, leur compatibilité doit être vérifiée. Contrôlez les paramètres ci-dessous pour qu’elles fonctionnent correctement en PCR multiplexe :
Les Tm (température de fusion)
Les différences entre les Tm des amorces doivent être réduites pour être les plus proches possibles afin qu’elles puissent fonctionner à la même température d’hybridation. Il est conseillé de faire le design des amorces avec des Tm autour de 60-65°C pour fonctionner avec un programme de PCR en 2 étapes.

Les structures des séquences :
Toutes les amorces ne doivent pas contenir :
- De structures secondaires stables comme les structures en tige-boucle
- De régions complémentaires de plus de 3 nucléotides en 3’.
La spécificité des amorces doit être rigoureusement vérifiée pour éviter toute amplification non spécifique. Des recherches de complémentarité entre les amorces, ainsi que les recherches d’homologie de chaque amorce avec les séquences d’ADN cibles sont également à réaliser. Des logiciels en ligne comme BLASTClustalWNetPrime sont disponibles en accès libre pour ces contrôles et, valider les séquences des amorces.  
Les longueurs des amplicons :
Si vous séparez les produits de PCR par électrophorèse, vous devez choisir des amorces de sorte que les tailles des séquences à amplifier soient suffisamment distinctes les unes des autres pour pouvoir les identifier sur gel et les séparer. L’écart minimal entre chaque fragment de PCR dépend :
- De la taille du fragment le plus long à amplifier dans une réaction de PCR multiplexe
- Du type de gel : un gel de polyacrylamide est généralement plus résolutif qu’un gel d’agarose
- Du système d’électrophorèse : gel ou capillaire
Par exemple, si la taille du fragment le plus long est de 1000 pb et si vous utilisez un gel d’agarose, il  faut compter au moins 100 pb d’écart. Vérifiez la résolution de votre système de séparation avant de définir les tailles des amplicons.

Validation par PCR
Chaque couple d’amorces doit être préalablement validé par PCR simplexe en utilisant une enzyme de PCR spécifique, car la PCR multiplexe amplifie plusieurs cibles dans une seule réaction et la spécificité de chacune des amplifications est primordiale. Il est recommandé d’utiliser une enzyme de PCR à démarrage à chaud (« Hot Start »), car elle permet d’éviter les amplifications non spécifiques en inactivant l’activité de l’enzyme à basse température, à laquelle les hybridations non spécifiques ont préférentiellement lieu.
VALIDATION DES AMORCES PAR PCR SIMPLEXE :
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Schéma montrant les étapes pour valider les amorces de PCR
La validation par PCR simplexe :
Chaque couple d’amorces doit être testé et validé individuellement en PCR simplexe avant de les multiplexer. Préparez un mélange réactionnel par cible de la même manière et suivez le même programme de PCR pour chaque mélange. Chaque PCR simplexe doit amplifier une seule séquence à la taille attendue. Si besoin, optimisez la température et/ou la durée d’hybridation, et/ou la durée d’élongation. Optimisez les conditions pour que toutes les PCR simples fonctionnent de manière optimale à la même température d’hybridation. Si ces ajustements ne suffisent pas pour obtenir des amplifications optimales, il est conseillé de réaliser le design de nouvelles amorces. Nous ne conseillons pas d’optimiser les mélanges réactionnels à ce stade.

Les optimisations de la PCR multiplexe :
Une fois que tous les couples d’amorces fonctionnent individuellement en PCR simplexe, vous pouvez commencer les essais en PCR multiplexe. Utilisez la durée d’hybridation et d’extension la plus longue et la température d’hybridation validées en PCR simplexe.

Le mélange réactionnel :
Il est conseillé de mélanger les couples d’amorces par petits groupes. Commencez par des essais avec 2, 3 ou 4 couples d’amorces, puis rajoutez 1 ou 2 couples d’amorces supplémentaires jusqu’à ce que toutes les amorces soient incluses. Mélangez tous les réactifs aux conditions validées en PCR simplexe. Les amorces à multiplexer sont en molarité égales au départ.

La programmation des cycles de la PCR :
La PCR en 2 étapes est plus spécifique et recommandée pour la PCR multiplexe plutôt que la PCR en 3 étapes.
La durée d’hybridation et d’élongation est souvent plus longue pour la PCR multiplexe à cause de la présence d’un nombre plus important d’amorces.
Selon l’enzyme à démarrage à chaud choisie, la durée de dénaturation initiale peut varier entre 1 à 2 minutes jusqu’à 15 minutes. Ceci est lié à la méthode utilisée pour inactiver l’enzyme à basse température. Il est important de bien respecter les consignes du fabriquant pour bénéficier pleinement de la performance de l’enzyme.
COMMENT OPTIMISER SON PROTOCOLE EN FONCTION DES RÉSULTATS OBTENUS ?
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Si les amplifications de toutes les cibles sont faibles : augmentez la durée de l’extension, ajustez la quantité d’enzyme et/ou de la matrice d’ADN.  Le volume maximal de l’enzyme ajouté ne doit pas dépasser 10 % du volume réactionnel. La température d’hybridation peut aussi être ajustée à la baisse, par palier de 2°C.

Si les amplifications des cibles ne sont pas homogènes : augmentez la concentration des amorces des cibles faiblement amplifiées.

Si on obtient des amplifications non spécifiques, augmentez la température d’hybridation par palier de 2°C ; augmentez la concentration en magnésium.
Dans certains cas, l’ajout d’additifs de PCR tels que la BSA, le DMSO peut être utile.
Il est recommandé de modifier un seul paramètre à la fois.
LE SAVIEZ-VOUS ?
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Des matrices d’ADN, des amorces ou des dNTPs qui fonctionnent pour la PCR simplexe ne fonctionneront pas systématiquement pour la PCR multiplexe. Car la PCR multiplexe est plus exigeante sur la qualité de ces réactifs. La matrice d’ADN doit être purifiée, intacte et sans inhibiteur. Utilisez uniquement des amorces purifiées par HPLC et des dNTPs ultra-purs. Il faut également éviter des cycles répétés de congélation/décongélation des réactifs.
FAQ
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Les gènes cibles n’ont pas été amplifiés de façon homogène ou tous les gènes n’ont pas du tout été amplifiés ?
Si les séquences cibles n’ont pas été amplifiées avec la même efficacité, vérifiez si la température d’hybridation et la durée d’élongation sont optimales pour les séquences faiblement amplifiées. Vérifiez également si ces séquences sont riches en GC. Si le programme de PCR est optimisé et que l’enzyme et/ou le tampon de réaction sont robustes, adaptés pour les séquences GC, vous pouvez diminuer les concentrations d’amorces pour les gènes fortement amplifiés ou inversement augmentez celles des gènes faiblement amplifiés.

Peut-on utiliser une Taq standard pour la PCR multiplexe ?
Oui, mais nous recommandons de travailler avec une enzyme de PCR robuste, sensible et spécifique. En PCR multiplexe, les différentes amorces doivent fonctionner efficacement dans un même mélange réactionnel et sous un même programme de PCR. De plus, des séquences cibles de taille et de complexité différentes sont à amplifier. Une enzyme robuste peut fonctionner dans des conditions plus variées et peut amplifier des séquences cibles difficiles (par ex. les séquences riches en GC).

La Taq’Ozyme HS est recommandée pour la PCR multiplexe. Les retours des utilisateurs confirment sa capacité à amplifier des séquences difficiles sans ou avec peu d’optimisation.

Pour plus informations sur la PCR multiplexe avec la Taq’Ozyme HS :

Sommaire
•     Le tutoriel

Tutoriel pour découvrir les conseils pour réussir une PCR multiplexe
OUTILS ACCESSIBLES EN LIGNE
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Logiciels de design des amorces multiplexes : PrimerPlexPrime3 PlusNetPrime

Logiciels de recherche d’homologie : BLAST (Basic Local Alignment Search Tool), ClustalW