TECHOZYME
LA VALIDATION DES ANTICORPS CELL SIGNALING TECHNOLOGY (CST) :
TOUT CE QU'IL FAUT SAVOIR
Introduction
La validation des anticorps est une étape importante dans la production d’anticorps. Elle doit être réalisée par le fabriquant lui-même et non l’utilisateur pour déterminer les conditions optimales d’utilisation de cet anticorps et aussi définir les applications et les espèces pour lesquelles il est validé. Un manque de validation est inévitablement une perte de temps pour le chercheur. Une bonne connaissance des performances et validations permet de choisir en connaissance de cause l’anticorps adapté à son besoin, et de gagner un temps précieux en suivant les recommandations, et protocoles validés en interne par le fournisseur pour obtenir des résultats de qualité quelque soit l’application. Il est essentiel d’avoir un œil critique sur les tests réalisés et les performances décrites par le fabricant et de savoir décrypter efficacement la fiche technique fournie. Par exemple, un anticorps validé exclusivement sur des lignées qui surproduisent la protéine cible a forcément une sensibilité assez faible ne permettant pas de détecter des protéines endogènes peu exprimées. Certains fabricants montrent des données d’utilisateurs qui ne remplacent en aucun cas les validations et contrôles qualités réalisés en interne par le fabricant.

Fort de son expérience, Cell Signaling Technology propose plus de 4 600 anticorps validés en Western Blot (WB), plus de 800 anticorps validés en immunofluorescence (IF), plus de 600 anticorps validés en immunohistochimie (IHC), plus de 550 anticorps validés en cytométrie de flux, plus de 300 anticorps validés en ChIP.
Rappels de notions importantes :
ANTICORPS POLYCLONAUX ET MONOCLONAUX : QU’EST CE QUI LES DIFFÉRENCIE ?
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Les anticorps monoclonaux ne reconnaissent, par définition, qu’un seul épitope alors que les polyclonaux reconnaissent plusieurs épitopes d’un même antigène. Les monoclonaux sont donc plus spécifiques ; leur mode de production assure une meilleure reproductibilité de lot-à-lot.
Les anticorps monoclonaux sont produits à partir de lignées cellulaires appelées les hybridomes, tandis que les anticorps polyclonaux sont préparés à partir de sérum d’animaux, couramment de lapins. Les animaux produisent des anticorps en réaction à l’injection d’une substance immunogène. La variabilité est donc « naturelle » quand on parle d’une réponse immunitaire. Les anticorps produits par plusieurs lapins en réaction à un même immunogène sont fréquemment différents. Cette variabilité biologique explique la non disponibilité d’un anticorps parfois pendant plusieurs mois lorsqu’un nouveau lot est produit, car il doit impérativement présenter les mêmes caractéristiques que le lot précédent et, dans le cas contraire cela impose de refaire un autre lot.
On comprend alors que la validation de chaque lot selon un cahier des charges très strict est essentielle et garantie un maintien des caractéristiques d’un anticorps de lot à lot.

Mais d’autres types de variabilité s’ajoutent. Le fait que plusieurs lots d’un même anticorps soient produits à partir du sérum d’un même lapin mais prélevés à des temps différents, altére la qualité de l’anticorps d’un lot à l’autre. Seule une validation rigoureuse de chaque production permet d’éviter cette variabilité naturelle.

La nature synthétique des anticorps monoclonaux évite ce problème de variabilité.

Cell Signaling Technology utilise depuis plusieurs années la technologie XMT™ qui permet de produire des monoclonaux de lapin XP™.
Cette technique permet de réduire la variabilité de lot à lot par rapport aux polyclonaux. Ces anticorps monoclonaux sont produits en immortalisant des cellules en culture productrices d’anticorps, cultivées in vitro. Ces cellules devraient pouvoir produire des anticorps indéfiniment, mais il est difficile de savoir si ces anticorps seront identiques au fil des années. C’est pourquoi des contrôles qualités sont incontournables pour assurer une reproductibilité de lot-à lot à chaque nouvelle production.

QU’EST CE QUI DÉTERMINE LA SPÉCIFICITÉ DES ANTICORPS ?
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Pour avoir des anticorps spécifiques, il faut aussi se préoccuper de ce qui se passe en amont et en aval de la production: le « design » des épitopes antigéniques et la purification des anticorps.
- Le « design » :
En effet, il convient de choisir comme épitope un fragment de la protéine qui soit unique comparé aux autres protéines de la même espèce. Il est assez courant que certains anticorps aient des réactions croisées avec d’autres protéines d’une même famille ou d’autres isoformes. Tout l’art réside donc dans le choix de cette séquence. C’est aussi la séquence choisie qui déterminera la réactivité sur d’autres espèces. Si l’homologie de séquence est proche de 100% entre l’épitope choisi dans une espèce et la même séquence dans d’autres espèces, on peut prédire que l’anticorps pourra reconnaitre spécifiquement cette même protéine chez d’autres espèces (indépendamment du % d’homologie de la protéine complète)

- La purification : La purification des anticorps se fait généralement par affinité. Si la purification est trop rapide, une accumulation de contaminants peut générer des réactions croisées. Généralement, la purification est faite sur protéine A (correspondant à l'isolement des immunoglobulines en général) complété par une purification par affinité (spécifique de l'antigène). Cette étape est primordiale par rapport à la spécificité, en effet un anticorps partiellement purifié peut donner un signal non spécifique sous forme de bruit de fond ou de bandes parasites en WB.
Il est important de noter que la notion de quantité en µg et de concentration en µg/ml entre différents anticorps de plusieurs fournisseurs ne permet pas de comparer ni les quantités à utiliser pour une expérience, ni les tarifs. En effet, ces données se rapportent à la quantité de protéines totales incluant des protéines et/ou anticorps contaminants dans le cas où l’anticorps n’est pas très pur.
Plus l’anticorps est pur, plus la spécificité est optimale et moins on utilise d’anticorps ; on travaille donc avec une concentration plus faible
Pourquoi faut-il valider un anticorps pour chaque application lors de la production d’un nouveau lot ?
Les anticorps ne sont utilisables que pour les applications dans lesquelles ils ont été validés.
Il est important de valider un anticorps en Western Blot sur des échantillons (tissus, lignées) qui ne surproduisent pas la protéine ciblée. En effet la validation doit être faite sur un lysat cellulaire issu de cellules exprimant la protéine cible endogène pour montrer la spécificité et la sensibilité de l’anticorps qui ne doit se fixer à rien d’autre que la protéine d’intérêt.
La sensibilité et la spécificité doivent être testées pour chaque application. Par exemple :
- Un anticorps peut donner un marquage correct en IF, mais donner des bandes de taille aberrante en WB.
- Un anticorps validé en WB ne fonctionne pas nécessairement en IHC ou en ChIP. En effet, en WB l’anticorps se fixe sur des protéines dénaturées et reconnait donc un épitope linéaire qui est constitué d’une suite contigüe d’acides aminés. Mais en ChIP, l’anticorps doit reconnaitre l’épitope en conformation native (non dénaturée), constitué d’acides aminés possiblement non contigus dans la protéine repliée, rendant inaccessible l’épitope.

Cependant, il y a des particularités. Un anticorps validé en IHC devrait fonctionner en IF et vice-versa. Or, ce n’est pas le cas. Pourquoi ? En IHC, les échantillons sont inclus en paraffine. Les protocoles utilisés peuvent endommager ou masquer les épitopes à cause des hautes températures et des réactifs chimiques utilisés (éthanol, xylène). L’étape de fixation entraine aussi une perte de certains antigènes sensibles. En IF sur cellules, la fixation se fait par une technique plus douce, entre autre en incubant 15 min en présence de formaldéhyde 4%.

En IHC, la fixation des tissus ou cellules se fait par immersion en tampon neutre formaline 10% pendant 18 à 24 heures (Nota bene : La formaline 100% est une solution aqueuse de formaldéhyde à 37% et de 10 à 15% de méthanol, solution couramment appelée formol). Ce réactif est moins efficace pour préserver les épitopes intacts que le formaldéhyde sans méthanol utilisé en IF. La fixation à la formaline rend nécessaire l’étape de démasquage de l’antigène. Cette étape se fait à haute température ce qui peut modifier la conformation native des protéines, au détriment de l’antigène. Pour pallier à ce problème, Cell Signaling Technology conseille de fixer directement les tissus sur l’animal entier après la mort par perfusion de formaldéhyde 4% pendant 10-15 min, préservant les épitopes sensibles.
Ce type de modification de protocole démontre bien qu’une validation pour une application ne vaut que si les conditions optimales sont données par le fournisseur d’anticorps et suivies à la lettre par l’utilisateur.

En effet aucun protocole n’est universel quelque soit l’anticorps utilisé. La validation d’un anticorps pour une application donnée implique donc de fournir toutes les données permettant de reproduire lors de l’utilisation les conditions optimales qui ont servies à la validation.
Étapes de validation des anticorps CST par application (WB, IHC, IF, FC, ChIP)
QUELLES SONT LES ÉTAPES DE VALIDATION DES ANTICORPS CST POUR LE WB ?
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.   Analyse de nombreuses lignées cellulaires et/ou tissus ayant des niveaux connus d’expression de la protéine cible et permettant une détermination précise de la
    réactivité d’espèce et de vérifier la spécificité.

.   Extinction de l’expression par siRNA : la transfection de siRNA ou l’utilisation de lignées KO (mutation sur le gène exprimant la protéine cible) permet de vérifier
    la spécificité de la cible.

.   Traitement par la phosphatase ou par des activateurs : le traitement de lignées cellulaires avec des facteurs de croissance, des activateurs chimiques ou des
    inhibiteurs, induisant ou inhibant l’expression de la protéine cible,  permet de vérifier la spécificité. Un traitement à la phosphatase permet de confirmer la
    phospho-spécificité.

.   Optimisation des conditions d’utilisation: les dilutions optimales et les tampons sont prédéterminés, les extraits cellulaires  à utiliser en contrôle positif et négatif
    sont précisés. Un protocole complet et optimisé est fourni pour vous faire gagner du temps et des réactifs.

  Test des lots : une comparaison des lots entre eux est réalisée pour assurer une reproductibilité de lot à lot. Les nouveaux lots sont calibrés par rapport aux
    précédents pour minimiser toutes variations de lot à lot.

QUELLES SONT LES ÉTAPES DE VALIDATION DES ANTICORPS CST POUR L’IHC ?
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.   Analyse en WB pour démontrer la spécificité du signal obtenu en IHC (bandes spécifiques en WB à la taille attendue pour la protéine cible, avec un minimum de
    bandes contaminantes).

.   Analyse des culots de cellules (dont le niveau d’expression est connu) inclues en paraffine, pour vérifier la spécificité envers la cible.

.   Performances de l’anticorps validé sur des modèles de tissus de souris cancéreux.

.   Des xénogreffes générées à partir de lignées dont le niveau d’expression est connu aident à vérifier la spécificité de l’anticorps envers sa cible.

.   Des puces avec des tissus humains cancéreux sont utilisées pour démontrer les performances sur un large spectre de tissus.

.   Des colorations de coupes fraiches de tissus sont réalisées si besoin

.   Les coupes de tissus et les culots de cellules sont soumis à des traitements à la phosphatase pour vérifier la phospho-spécificité.

.   L’utilisation de peptides bloquants permet de vérifier la spécificité et d’écarter la fixation à des récepteurs de la région Fc des igG et tous les autres marquages
    non spécifiques.

.   Les différents lots sont testés pour assurer une reproductibilité des résultats en IHC d’un lot à l’autre.

.   Optimisation des conditions d’utilisation : les dilutions optimales et les tampons sont prédéterminés, les extraits cellulaires à utiliser en contrôle positif et négatif
    sont précisés. Un protocole complet et  optimisé est fourni pour vous faire gagner du temps et des réactifs. Certaines lames contrôles sont aussi disponibles.

QUELLES SONT LES ÉTAPES DE VALIDATION DES ANTICORPS CST POUR L’IF ?
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Elles sont du même type que celles réalisées pour l’IHC avec en complément :
  L’optimisation des conditions de fixation et perméabilisation. Des protocoles alternatifs sont recommandés si nécessaire.

  Le protocole est optimisé pour obtenir le meilleur rapport signal/bruit de fond.

.   La localisation subcellulaire est vérifiée sur cellules et sur tissus.
QUELLES SONT LES ÉTAPES DE VALIDATION DES ANTICORPS CST POUR LA FC ?
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.   Des dilutions successives sont utilisées pour déterminer la dilution optimale.

.   Comparaison  du signal à celui obtenu avec un isotype contrôle pour estimer la fixation non spécifique des anticorps primaires.

.   Utilisation de lignées cellulaires connues comme positives ou négatives pour vérifier la spécificité envers la cible.

.   Traitement des lignées cellulaires par des inhibiteurs ou des activateurs spécifiques d’une voie de transduction pour vérifier la spécificité.

.   Des peptides bloquants, des siRNA et des vecteurs d’expression permettent de vérifier la spécificité du marquage.

.   Un traitement phosphatase est utilisé pour confirmer la phospho-spécificité d’un anticorps

.   Des contrôles qualité approfondis garantissent la stabilité dans le temps et élimine les variabilités de lot à lot.
QUELLES SONT LES ÉTAPES DE VALIDATION DES ANTICORPS CST POUR LE CHIP ?
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.   Les anticorps CST pour le ChIP sont testés avec le kit SimpleChip® Plus enzymatic Chromatin IP kit (Magnetic beads) #9005 en vue d’obtenir le meilleur
    enrichissement possible aux loci testés. L’ADN enrichi en un locus précis est quantifié par qPCR avec des amorces spécifiques du locus.

.   Les anticorps spécifiques des histones modifiées sont validés par des tests ELISA en utilisant un peptide compétiteur pour démontrer la spécificité vis à vis
    d’une modification donnée.
QUESTION FRÉQUEMMENT POSÉES
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Comment choisir un anticorps CST parmi tous ceux dirigés contre ma protéine d’intérêt ?
- Sélectionner uniquement les anticorps validés pour son application et son espèce.
- Prendre le plus sensible et le plus spécifique, en général c’est le monoclonal de lapin XP™. Un anticorps monoclonal de lapin offre une meilleure réponse immune, affinité et sensibilité, une excellente reproductibilité. Enfin, il est recommandé pour l’IHC sur les coupes murines (car bruit de fond atténué).

Si aucun des anticorps disponibles ne convient pour l’application et l’espèce, au lieu de tester au hasard, contactez le Service Technique Ozyme (tech@ozyme.fr – 01 34 60 60 24) pour se renseigner :
- Des validations sur une technique (la technique ne fonctionne pas ou elle n’a pas été testée)
- Du % d’homologie entre peptide antigénique utilisé par CST et la même séquence sur son espèce modèle. Si le % obtenu par alignement de séquence est supérieur à 95%, il est intéressant de tester l’anticorps.
Comment choisir entre un monoclonal de souris et un monoclonal de lapin ?
Il est recommandé de choisir l’anticorps de lapin s’il est validé pour votre espèce et votre application, surtout si vous travaillez sur des échantillons humains. En fait nous sommes beaucoup plus proches de la souris que du lapin (organisme pourtant supérieur à la souris).
Le lapin étant un organisme supérieur par rapport à la souris, la réponse immunitaire générée est plus forte et plus complexe et donc la probabilité d'isoler un clone est plus grande.
En effet, l'immunisation du lapin est faite par un petit antigène humain (peptide) qui donnera un anticorps très spécifique dirigé contre une forme phosphorylée ou clivée. Le lapin a une plus grande sensibilité aux antigènes (peptides) humains en raison des très faibles homologies de séquence entre l'homme et le lapin. Ce qui n'est pas le cas pour la souris qui génère une réponse immunitaire faible pour un même peptide humain car souvent la séquence du peptide humain est homologue à la séquence de la souris et donc le reconnaît comme "soi". C’est aussi recommandé si vous travaillez sur le rat ou la souris en IF ou IHC, vous éviterez ainsi l’apparition d’un bruit de fond avec un secondaire anti-souris qui pourrait reconnaitre des Ig endogènes à l’échantillon.


Quel est le pourcentage minimal d’homologie recommandé entre l’antigène utilisé pour produire l’anticorps et la même séquence de sa protéine cible d’une autre espèce pour avoir une chance d’obtenir un signal ?
Nous recommandons en général de tester si le % d’homologie est égale ou supérieure à 95%.


Pourquoi dois-je suivre rigoureusement le protocole de CST ?
Ce protocole correspond aux conditions optimales déterminées par CST pour un anticorps donné définies grâce aux étapes de validation, permettant d’obtenir le meilleur ratio signal/bruit de fond, la meilleure sensibilité et la plus grande spécificité.


Comment trouver les conditions validées par CST ?
Les conditions d’utilisations sont indiquées sur la fiche technique en pdf qui est en ligne et fournie avec le produit (dilution pour chaque application, tampons à utiliser…).
- Retrouvez ces conditions d’utilisation sur la fiche technique
Fiche technique CST pour retrouver les conditions validées par CST

Protocole dédié à un anticorps pour une application donnée : combinant le protocole général et les indications spécifiques à un anticorps, à consulter sur le site CST :


Quels contrôles dois-je toujours utiliser ? et pourquoi ?
Il est important pour obtenir des résultats fiables de toujours introduire des contrôles positifs et négatifs dans son expérience. Ces contrôles ont été utilisés par CST pour réaliser les validations des anticorps. Pour les anticorps dirigés contre les formes phosphorylées, le contrôle est de faire un second WB identique avec un anticorps reconnaissant la forme totale de la protéine (quelle soit modifiée ou non). Cela permettra de savoir si l’on n’observe aucun signal avec un anticorps anti-phospho-protéine, si la protéine est totalement absente de l’extrait (non exprimée) ou si elle n’est présente que sous sa forme non phosphorylée. On pourra en conséquence modifier la préparation de ses échantillons (ajout d’inhibiteurs de phosphatases si on suspecte que la phosphorylation a été détruite au cours de la préparation de l’échantillon, modification des conditions de traitement des cellules pour obtenir l’activation de la voie de transduction).

La fiche technique indique aussi les contrôles positifs et négatifs utilisés lors de la validation (ex : lignées donnant une bande intense de la protéine en WB, ou tissus en IHC).

Certains sont disponibles au catalogue sous forme de lysats contrôles (pour le WB) ou de lames contrôles (pour l’IHC)