TECHOZYME
DÉCOUVREZ COMMENT OPTIMISER LES PERFORMANCES DE LA TRANSFECTION DE siRNA
INTRODUCTION
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La transfection de siRNA est une approche qui permet d’inhiber l’expression des gènes (« gene-silencing ») et donc de réguler leur expression. Il est important de déterminer les meilleures conditions qui donnent une extinction maximale du gène ciblé, tout en maintenant un niveau satisfaisant de viabilité cellulaire. Nous allons voir dans ce TechOzyme quels sont les critères primordiaux pour optimiser la transfection de siRNA et obtenir la meilleure extinction du gène d’intérêt.
POURQUOI TRANSFECTER DES siRNA ?
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Les petits ARN interférents (ou siRNA, « small interfering RNA ») sont des petits ARN double brin de 21 à 24 paires de bases. Ils peuvent inhiber l’expression d’un gène en dirigeant la coupure (ou clivage) des ARN qui leur sont complémentaires ou en inhibant la traduction d’une séquence génétique spécifique.

Quel est le mécanisme de l’interférence ARN par les siRNA ?
Les siRNA sont reconnus dans le cytoplasme de la cellule par un complexe protéique, nommé complexe RISC (RNA Induce Silencing Complex). Celui-ci s'active en libérant le brin complémentaire de l'ARN ou brin sens. Le complexe activé reconnait son transcrit cible, un ARN messager, par complémentarité des bases. Ce système de reconnaissance assure la haute spécificité du mécanisme. Une fois la cible liée, l’endonucléase Argonaute (Ago), appartenant au complexe RISC, coupe le transcrit au niveau du site de reconnaissance. Les deux morceaux du transcrit clivé par Ago sont rapidement dégradés via leurs extrémités par des exonucléases. La transfection de petits ARN interférents dans les cellules a donc pour conséquence la destruction spécifique des ARN messagers ciblés, empêchant toute nouvelle traduction de la protéine codée par ces ARN messagers.

Schéma du principe de l’interférence ARN
Principe montrant le principe de l'interférence ARN, inhibition de gènes
COMMENT CHOISIR ET PRODUIRE UNE SÉQUENCE DE SIRNA ?
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Le « design » des siRNA est crucial pour déterminer leur efficacité à cibler l’ARNm. Voici ci-dessous les critères essentiels à respecter :
•   Trouver une séquence de 21 nt dans l’ARNm cible qui commence par le dinucléotide AA
•   Eviter les régions à moins de 50-100 bp du codon start ATG et du codon stop
•   Eviter les régions introniques
•   Eviter les répétitions de 4 bases ou plus comme AAAA, CCCC
•   Eviter les régions avec un contenu en GC < 30 % ou > 60 %. Les siRNA avec un contenu en GC proche de 50 % sont plus actifs
•   S’assurer que la séquence choisie est spécifique du gène à cibler en réalisant une recherche d’homologie à l’aide du logiciel BLAST, pour éviter les effets « off-targets » sur d’autres gènes apparentés ou non
•   Commander la séquence (synthèse chimique) et son contrôle, ou la produire par transcription in-vitro, par expression à partir d’un vecteur ou à partir de cassettes d’expression PCR

Il est fortement recommandé de tester au moins 3 molécules de siRNAs ciblant des régions non chevauchantes de l’ARNm cible. En effet, si un siRNA produit un phénotype particulier et que le second siRNA testé (destiné à éteindre le même gène) produit un phénotype différent du premier, il est impossible de conclure que le gène d’intérêt a été éteint efficacement.
COMMENT OPTIMISER LA TRANSFECTION DE siRNA ?
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Mieux connaître le gène cible pour mieux le cibler
Concevoir la séquence du siRNA aussi efficacement que possible en utilisant plusieurs algorithmes. L’efficacité du siRNA sera d’autant meilleure que sa concentration nécessaire pour une extinction optimale du gène d’intérêt sera faible.
Vérifier les demi-vies à la fois de la protéine et de l’ARNm d’intérêt pour déterminer la meilleure fenêtre d’analyse. Il est conseillé de mesurer l’extinction du gène entre 24 à 96 heures après la transfection

Utiliser des siRNA de qualité
S’assurer de la pureté des siRNA. Ils doivent être en effet exempts de nucléotides, oligomères, protéines, éthanol et sels. Les ARN double-brin contaminants de plus de 30 bp peuvent altérer l’expression du gène, en provoquant une réponse antivirale de type interféron non spécifique entrainant la dégradation non spécifique des ARNm.

Titrer le siRNA pour une meilleure spécificité
Utiliser de faibles concentrations en siRNA permet de s’affranchir des effets « off-targets* », mais aussi de limiter les effets toxiques pour la cellule transfectée. Il est recommandé de tester différentes concentrations de siRNA en fonction du type cellulaire et du gène ciblé. Cependant, la concentration en siRNA doit toujours être comprise entre 1 et 50 nM et ne jamais excéder 50 nM. En effet, au-delà de 50 nM, le résultat de transfection ne sera jamais représentatif de la réalité en raison des effets « off-targets ».
*Qu’est ce qu’un effet « off-target » ? Un effet « off-target » ou «hors-cible» est un effet non désiré qui survient lorsque le siRNA transfecté est traité par le complexe RISC et affecte un ARNm qui n’est pas destiné à être ciblé.
 
Préparer une solution stock de siRNA appropriée
Quand on utilise de faibles concentrations en siRNA, il est nécessaire d’adapter la concentration de la solution stock de siRNA pour pipetter des volumes précis. Il faut procéder de la même manière pour les petits volumes d’agent de transfection : diluer de 1 à 5 fois dans de l’eau stérile.

Choisir le milieu de culture et les conditions de culture appropriés
Des antibiotiques ne sont pas forcément nécessaires et peuvent devenir toxiques lors de la transfection. De plus, certains transfectants de siRNA requièrent que la transfection soit menée dans des milieux sans sérum ou à faible pourcentage de sérum. De manière générale,  il est recommandé d’utiliser le milieu adapté à son type cellulaire ; certaines cellules nécessitent plus de glucose que d’autres ou ont besoin d’acides aminés additionnels.
Pour améliorer l’efficacité d’extinction, la transfection peut être réalisée dans un volume de milieu de croissance réduit de moitié et le milieu peut aussi être remplacé 4 heures après la transfection.

Vérifier la qualité du sérum
Certains lots de sérum peuvent diminuer drastiquement l’efficacité de transfection et ainsi engendrer une moindre efficacité d’extinction du gène d’intérêt. Il est donc important de vérifier l’efficacité de différents lots de sérum avant de réserver un nouveau batch.

Transfecter des cellules saines
Pour maximiser la viabilité cellulaire durant la transfection, les cellules doivent être en bonne santé au début de l’expérience. Des cellules saines sont plus faciles à transfecter que des cellules mal entretenues. Les points suivants sont alors à respecter :
•   Passer les cellules au moins deux fois après décongélation pour leur permettre de récupérer avant la transfection
•   Utiliser des cellules à faible nombre de passages (< 20 passages). En effet, au fil du temps, les caractéristiques phénotypiques et de croissance des cellules divergent, et donc leur profil d’expression également comparé à des cellules à faible nombre de passages
•   Eliminer les cultures de cellules trop confluentes
•   Vérifier régulièrement les contaminations par des mycoplasmes, levures ou bactéries
•   Faire pousser les cellules la veille de la transfection à la confluence recommandée par le fournisseur de l’agent de transfection. Si vous utilisez l’INTERFERin®, il est recommandé d’utiliser un degré de confluence entre 30 et 50 % au moment de la transfection
En savoir plus sur l’INTERFERin®
Utiliser des contrôles positif et négatif
Des contrôles appropriés doivent être intégrés à chaque expérience, non seulement pour suivre l’efficacité de la transfection, mais aussi pour s’assurer de la validité des données.
•   Utiliser un siRNA contre un gène de ménage (GAPDH, cyclophylin B) à différentes concentrations comme contrôle positif permettant d’optimiser les conditions expérimentales de transfection et de s’assurer que l’extinction obtenue lors de la transfection du siRNA d’intérêt est fiable. Il s’agit en fait de cibler des protéines résidentes hautement exprimées ayant un effet biologique facilement mesurable

•   Utiliser un contrôle négatif commercial c’est à dire un siRNA non spécifique (siRNA dit « scramble » avec un mismatch ou siRNA non dirigé contre le gène d’intérêt à éteindre) permettant de vérifier la spécificité de l’effet du siRNA en effectuant une expérience parallèle avec un contrôle qui ne cible aucun transcrit cellulaire. Le siRNA « scramble » doit avoir la même longueur et la même composition nucléotidique que le siRNA d’intérêt, mais contenir au moins 4 à 5 bases différentes du siRNA d’intérêt. Il est cependant nécessaire de contrôler que le mismatch ne crée pas d’homologie avec d’autres gènes

•   Eviter les siRNA fluorescents contrôles quand on travaille à de faibles concentrations de siRNA, car de hautes concentrations en siRNA sont nécessaires pour leur détection (20-50 nM)

•   Il ne faut pas non plus oublier d’effectuer une expérience de contrôle sans siRNA.

Suivre le protocole validé avec l’agent de transfection utilisé
Il est important d’optimiser la quantité d’agent de transfection utilisée lors de la transfection. En effet, trop peu de transfectant limite la transfection et au final, rend l’extinction inefficace. Trop de transfectant peut être cytotoxique.
Certains transfectants sont inhibés par le sérum ou les antibiotiques. D’autres au contraire (comme l’INTERFERin®), peuvent être utilisés en présence de milieu contenant du sérum et des antibiotiques, ce qui diminue les risques de toxicité et le nombre d’étapes dans le protocole (inutile de changer de milieu).

Il est également recommandé de vérifier le pourcentage de confluence des cellules au moment de la transfection. En effet, certains agents de transfection comme l’INTERFERin® doivent être utilisés avec des cellules ayant une confluence comprise entre 30 et 50 %
Le temps de formation des complexes siRNA et transfectant peut aussi être modulé. Pour l’INTERFERin®, l’incubation standard dure 10 minutes. Sa durée peut être augmentée, mais ne peut excéder 30 minutes.

Il peut être aussi nécessaire de contrôler le temps de contact des complexes siRNA-agent de transfection avec les cellules pour limiter la cytotoxicité, tout en maintenant un bon silencing. Pour cela, il est recommandé de remplacer le milieu contenant les complexes siRNA-agent de transfection avec du milieu de croissance normal 8 à 24 heures après la transfection

Mesurer l’extinction du gène à différents temps après la transfection pour trouver la fenêtre optimale
Il est recommandé de mesurer le niveau des ARNm 24 à 48 heures après la transfection. Dans certains cas, l’extinction au niveau protéique est aussi évaluée pour comprendre les effets biologiques du traitement par le siRNA. Celle-ci est habituellement estimée 48 à 72 heures après la transfection du siRNA. La diminution de l’expression en protéines est affectée par la vitesse du » turn-over » (ou demi-vie) de l’ARNm et des protéines ; de ce fait, le moment optimal pour observer le « knockdown » maximal au niveau protéique peut varier largement selon les gènes ciblés.

Stocker correctement les réactifs
L’ INTERFERin® doit être stocké à +4°C après réception. Il ne doit surtout pas être congelé. Les siRNA doivent être aliquotés et stockés à -20°C.
QUESTIONS FRÉQUEMMENT POSÉES
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Quelle est la différence entre une transfection reverse et une transfection forward ?
Dans le protocole standard dit forward, les cellules sont étalées 24 heures avant la transfection.

Dans la méthode alternative dite reverse, les cellules sont étalées et transfectées en simultané. Ce protocole, plus facile, permet de gagner un jour dans la procédure et de diminuer les concentrations de siRNA utilisées (réduction des effets « off-targets » et aussi du coût). De plus, sur certaines lignées, il donne de meilleures efficacités de transfection. Vraisemblablement, l’étendue de la surface cellulaire exposée et non le nombre de complexes de transfection, est le facteur limitant dans la transfection adhérente traditionnelle. La transfection réverse est supposée augmenter l’exposition cellulaire aux complexes de transfection générant souvent  une meilleure efficacité.

Comment quantifier l’effet du siRNA ?
Au niveau de l’ARNm : par Northern blot, par RT-PCR, ou par qRT-PCR
Au niveau de la protéine : par Western blot, par immunofluorescence, par cytométrie en flux, par des tests phénotypiques ou fonctionnels
Il est recommandé de vérifier en amont la bonne performance de ces tests (par exemple : s’assurer de la spécificité de l’anticorps, valider les amorces de la qRT-PCR, …).

Faut-il obligatoirement utiliser des siRNA pour faire du gene-silencing ?
Il est également possible d’éteindre un gène en utilisant des shRNA (short-hairpin RNA) par intégration virale ou par transfection classique.
LE SAVIEZ-VOUS ?
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Il est plus facile de transfecter du siRNA que de l’ADN. Pourquoi ?
Le siRNA cible l’ARNm présent dans le cytoplasme des cellules, comparativement à l’ADN plasmidique qui doit atteindre le noyau pour agir.

Pourquoi dans une expérience de siRNA est-il judicieux de contrôler les niveaux d’ARNm et de protéines ?
Il y a plusieurs raisons. Par exemple, une réduction du niveau d’ARNm sans diminution des niveaux de protéine indique que le turn-over protéique est lent. Une baisse du niveau de protéine en l’absence de réduction d’ARNm suggère que le siRNA affecte l’ARNm et en empêche la traduction.