TECHOZYME
RÉALISER VOS QPCR MULTIPLEXE DANS LES MEILLEURS CONDITIONS
La qPCR multiplexe permet de détecter plusieurs cibles dans un même tube en mélangeant les amorces et/ou les sondes spécifiques. Ainsi, un gène cible et un gène de référence peuvent être détectés dans une seule réaction pour étudier les expressions géniques ; ou un gène sauvage et un ou plusieurs gènes mutants peuvent être détectés simultanément dans le cadre du génotypage.
Le multiplexage permet d’économiser du temps, des réactifs et des consommables et élimine le problème des erreurs de pipetage.
Pour les échantillons précieux et/ou en faible quantité comme des échantillons FFPE ou des biopsies de tumeurs, la qPCR multiplexe est souvent une solution appropriée, car elle permet d’obtenir davantage de résultats que la qPCR simplexe.

Il y a principalement deux sortes de qPCR multiplexe : multi-couleurs ou monochrome.
L’approche multi-couleurs est la plus utilisée et nécessite des sondes spécifiques marquées par des fluorochromes avec des spectres distincts et compatibles en multiplexe.

L’approche monochrome peut être envisagée lorsque les Tm des amplicons cibles  sont suffisamment différents et peuvent être différenciés en multiplexe. Un seul intercalant fluorescent comme le SYBR® Green I ou l’EvaGreen® suffit pour réaliser la PCR multiplexe monochrome.
Nous décrivons  dans ce TechOzyme les étapes et les points importants pour mener à bien la qPCR multiplexe multi-couleurs.
CONCEPTION D’UNE EXPÉRIENCE DE QPCR MULTIPLEXE
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La conception est une étape très importante pour réussir une qPCR multiplexe. Les points ci-dessous doivent être pris en considération dès le début :

- Vérifier le nombre de multiplexes réalisables sur votre appareil
Le nombre maximal de cibles à multiplexer dépend du système optique de chaque appareil de qPCR. Il existe des appareils capables de détecter 4 voire 6 fluorochromes. Consultez le manuel de votre appareil pour vérifier le nombre de canaux de détection disponibles.

Le tableau ci-dessous récapitule la compatibilité des appareils de qPCR avec les fluorochromes :
Table présentant la compatibilité des appareils de qPCR avec les fluorochromes
- Choisir les fluorochromes reporters
En fonction du système optique de l’appareil de qPCR, sélectionner les fluorochromes reporteurs compatibles avec la source d’excitation et les filtres de détection. Les fluorochromes sélectionnés doivent également avoir des spectres d’émission distincts pour minimiser au mieux les « cross-talk ». Utilisez des fluorochromes plus intenses (tel que le FAM) pour les gènes faiblement exprimés, et moins intenses pour les gènes fortement exprimés comme les gènes de référence.
Le tableau ci-dessous récapitule les caractéristiques des fluorochromes utilisés pour la qPCR multiplexe :
Caractéristiques des fluorochromes pour la qPCR multiplexe
- Choisir les extincteurs
L'extincteur (quencher) est une molécule capable d'absorber l'énergie (la fluorescence) émise par un fluorochrome, entrainant l'extinction de la fluorescence de ce dernier.
• Choisir les extincteurs en fonction de leur spectre d’absorption pour qu’ils soient compatibles avec les fluorochromes reporters.
Privilégier les extincteurs (« Quencher ») les plus efficaces pour la qPCR multiplexe. Si besoin utiliser des extincteurs associés à un deuxième extincteur comme le ZEN™, pour minimiser le « cross-talk » entre les fluorochromes.

• Eviter les extincteurs fluorescents comme le TAMRA et privilégier les extincteurs non fluorescents (Dark Quenchers) comme le BHQ (Black Hole Quencher) ou QSY. Ceci permet à la fois de libérer un canal de détection et de minimiser le « cross talk ». Par exemple, si le TAMRA n’est pas utilisé comme extincteur, le NED peut être utilisé avec le FAM et le  VIC pour réaliser une qPCR triplexe.


- Désigner les amorces et les sondes
• Désigner les amorces spécifiques à chaque cible avec des Tm autour de 58 à 62 °C. Les Tm des sondes doivent être de 8 à 10 °C supérieurs aux Tm des amorces.

• La taille des amorces est généralement autour de 18 à 28 nucléotides et celle des sondes de 30 à 40 nucléotides. Les amplicons doivent être courts de  50 à 150 paires de base.  

• La spécificité des amorces et des sondes doit être vérifiée pour éviter les amplifications non souhaitées. Utiliser les logiciels en ligne comme le BLAST pour vérifier si vos amorces et sondes présentent des homologies avec des séquences non ciblées (cf la section « outils accessibles en ligne »).

• Rechercher également si des complémentarités existent entre les amorces et les sondes du multiplexe. Pour que la qPCR multiplexe fonctionne de manière optimale, les séquences ne doivent pas avoir de complémentarité, en particulier en 3’. Généralement, il faut éviter des complémentarités de plus de 3 nucléotides ainsi que des G et C en 3’. Les amorces et sondes ne doivent pas inclure de structures en tige-boucle.
Des outils accessibles en ligne permettent de vérifier la présence de ce type de structures dans les amorces ou sondes. (cf la section « outils accessibles en ligne »)
VALIDATION
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Validation en simplexe
Dans un premier temps, la spécificité, l’efficacité et la sensibilité de l’amplification de chaque cible doivent être validées individuellement en qPCR simplexe. Optimiser si besoin pour que chaque qPCR simplexe  fonctionne avec le même programme.

Validation en multiplexe
Réaliser ensuite la qPCR multiplexe en suivant le protocole validé précédemment en simplexe. Les Ct obtenus en qPCR multiplexe doivent être très proches ou identiques à ceux obtenus en simplexe. Les ΔRn (les intensités de fluorescence) peuvent décroître pour certaines cibles en réaction multiplexe mais souvent sans impact sur le Ct ou la sensibilité de la détection.  Les efficacités de qPCR de chaque cible doivent rester proches du 100% en multiplexe.
OPTIMISATIONS
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La qPCR multiplexe ne fonctionne pas toujours avec les mêmes conditions validées en qPCR simplexe. Le nombre d’amorces, de sondes et de produits d’amplification dans une réaction multiplexe est plus élevé, et peut être à l’origine de carences en Mg2+, en dNTP ou en ADN polymérase. Quand certains produits d’amplification atteignent la saturation, ils peuvent inhiber les autres amplifications.

De plus, il peut y avoir de la compétition entre les amplifications des différentes cibles au sein  d’une réaction en multiplexe. Dans ce dernier cas, les cibles les plus abondantes sont amplifiées en priorité et les cibles en faible quantité sont peu ou pas du tout amplifiées. C’est pourquoi, il est important de vérifier que l’ADN, les dNTP et le le Mg2+ dans le mélange réactionnel ne sont pas en quantité limitante. Augmenter les quantités de ces réactifs si besoin.

Certains fournisseurs offrent des prémix dédiés à la qPCR multiplexe incluant des réactifs en quantité optimale. Certains prémix pour simplexe peuvent également très bien fonctionner en qPCR multiplexe grâce aux performances de l’enzyme et du tampon.

Si des amplifications de certaines cibles en multiplexe ne sont pas efficaces ou si des biais d’amplification persistent malgré les optimisations citées ci-dessus, dans ce cas on conseille d’ajuster la concentration des amorces et/ou des sondes en fonction de l’abondance des cibles. 

Trois scénarios sont possibles :
1 - Une partie des cibles est plus abondante (souvent le gène de référence)  
Diminuer les concentrations des amorces des cibles abondantes jusqu’à la concentration la plus faible à laquelle le Ct reste au plus précoce. Cette concentration est appelée le seuil d’amorce (« Primer Limit ») (plus d’informations dans la section FAQ « comment déterminer le seuil d’amorce pour une cible » de ce TechOzyme). Si besoin, la concentration des amorces des cibles en faible quantité peut être augmentée à condition que cela n’influence pas la spécificité.

2 - Les niveaux d’expression de toutes les cibles sont identiques
Dans ce cas, il n’est pas nécessaire d’ajuster la concentration des amorces. Si les amplifications en multiplexe de certaines cibles échouent, il est conseillé de redésigner les amorces et/ou sondes de ces cibles.

3 - Les niveaux d’expression de toutes les cibles sont variables en fonction des échantillons
Utiliser toutes les amorces du multiplexe en concentration de seuil d’amorce.

Le ratio molaire standard entre l’amorce et la sonde est de 2 :1. Diminuer ce ratio jusqu’à 1 : 1 pour les gènes abondants et l’augmenter pour ceux en faible quantité.
LE SAVIEZ-VOUS ?
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Un appareil de qPCR doit être calibré avant l’utilisation de nouveaux fluorochromes 
Les appareils de qPCR sont généralement calibrés systématiquement par rapport aux fluorochromes « standard ». Mais un appareil peut détecter d’autres fluorochromes pour lesquels il n’est pas forcément calibré. Vérifiez si votre appareil est calibré pour les fluorochromes de votre choix. Sinon, calibrer l’appareil avec les nouveaux fluorochromes avant de réaliser la qPCR. De plus, il est recommandé de recalibrer les appareils régulièrement (par exemple tous les six mois). Une bonne calibration garantit l’uniformité de la détection entre les puits en assurant la spécificité de détection et minimisant les bruits de fond ou le « cross-talk » entre les  fluorochromes lors de la qPCR multiplexe.


Comment comparer les résultats de différents puits/tubes d’un essai en multiplexe
Si un gène de référence est mélangé avec un ou plusieurs gènes cibles dans un même puits/tube, il faut d’abord normaliser en rapportant le Ct du gène cible à celui du gène de référence avant de comparer les résultats des différents puits/tubes. Cette règle doit s’appliquer pour les calculs des moyennes des repliquats (duplicat, triplicat …).


Quels sont les facteurs qui  influencent l’intensité absolue du signal d’un fluorochrome ?
L’intensité de fluorescence absolue d’un fluorochrome est directement proportionnelle au coefficient d’extinction et au rendement quantique de celui-ci. Le rendement quantique dépend de la longueur et de la séquence de l’oligonucléotide marqué par le fluorochrome, du tampon (la concentration en sels, le pH…) dans lequel l’oligonucléotide marqué est resuspendu. L’intensité de fluorescence des fluorochromes est également influencée par la température. L’importance de l’impact de la température dépend de la thermo-résistance des structures chimiques des  fluorochromes.
La figure 1 montre les effets de la température sur les intensités de fluorescence des fluorochromes utilisés en qPCR (Salvatore A.E. Marras, « Methods in molecular biology : fluoroescent energy transfer nucleic acid probes : desing and protocols ». Editated by v.v. Didenko, Humana Press Inc., Totowa, NJ).
Effets de la température sur les intensités de fluorescence des fluorochromes
L’intensité de fluorescence détectée d’un fluorochrome est également liée au système optique de l’appareil (par exemple la source d’excitation, les filtres d’excitation et d’émission), du multiplexage et des conditions expérimentales.
QUESTIONS FRÉQUEMMENT POSÉES (FAQ)
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Comment déterminer le seuil d’amorce pour une cible ?
Réaliser une série de qPCR simplexe avec des concentrations décroissantes d'amorces pour une cible. La concentration la plus faible juste avant l’augmentation du Ct est le seuil d’amorce de la cible. La Figure 2 décrit une expérience pour déterminer le seuil d’amorce : les concentrations des amorces testées sont 100 nM, 75 nM, 50 nM, 25 nM et 10 nM (A – E). A 75 nM (la courbe d’amplification B), le Ct est toujours le plus précoce et il commence à accroître à 50 nM (la courbe d’amplification C). Le seuil d’amorce est donc 75 nM pour cette cible.
Déterminer le seuil d’amorce pour les concentrations des amorces
Comment calibrer un appareil de qPCR ?
Il faut calibrer l’appareil avec des fluorochromes purs identiques à ceux utilisés en qPCR. Il n’est pas recommandé d’utiliser des fluorochromes équivalents dont les spectres sont similaires. Le protocole de calibration est spécifique à chaque appareil. La procédure standard de calibration est la suivante : préparer une gamme de dilution par fluorochrome indiquée par le fabriquant. Les dilutions sont à faire dans le même tampon que celui utilisé pour la réaction de qPCR. Distribuez les dilutions du fluorochrome dans les puits d’une plaque. Utilisez une plaque par fluorochrome. Enfin, suivre les instructions dans le menu du logiciel de l’appareil pour finaliser la calibration.

Que doit-on choisir pour la RT-qPCR en multiplexe : la RT-qPCR en 1-étape ou en 2-étapes ?
La RT-qPCR en 2-étapes est recommandée. En effet pour la RT-qPCR en 1-étape, ce sont les mêmes concentrations d’amorces qui sont utilisées pour la RT et la qPCR,  il y a donc moins de souplesse pour les optimisations.

La saturation en qPCR multiplexe, qu’est-ce que c’est ?
La saturation en qPCR multiplexe est souvent observée lorsque le ou les gènes abondants sont amplifiés en premier et tous ou une partie des réactifs du mélange réactionnel deviennent limitant. La saturation en qPCR multiplexe empêche l’amplification du ou des gènes en faible quantité.

Comment déterminer le niveau d’expression de mon gène ?
Le tableau ci-dessous indique le niveau d’expression d'un gène en fonction du Ct obtenu :
Niveau d’expression d'un gène en fonction du Ct obtenu
OUTILS ACCESSIBLES EN LIGNE
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Désigner des amorces pour la qPCR multiplexe

Vérifier la spécificité des amorces et sondes
- USCS Genome Browser: www.genome.ucsc.edu

Vérifier les dimères d’amorces ou les complémentarités entres les amorces/sondes
- OligoAnalyzer Software: https://eu.idtdna.com/calc/analyzer
- mFold : http://unafold.rna.albany.edu/?q=mfold/DNA-Folding-Form

Les bases de données des amorces pré-désignées
- Real Time PCR Primer Sets : www.realtimeprimers.org/