TECHOZYME
TOUT SAVOIR SUR LA TRYPSINISATION DE VOS CELLULES EN CULTURE
La trypsinisation est une étape importante dans l’entretien des cellules en culture en permettant de :
•   Détacher les cellules adhérentes de leur support de culture et de les dissocier entre elles
•   Digérer enzymatiquement par la trypsine les protéines de la matrice extracellulaire formant les jonctions entre les cellules créant un tapis cellulaire
Lors des repiquages ou passages quand les cellules arrivent à confluence, on dissocie les cellules pour pouvoir les diluer dans un milieu frais. Une mauvaise optimisation du protocole de trypsinisation a des conséquences sur la mortalité, sur l’adhésion des cellules au support, sur la croissance et la morphologie.
La nature des cellules et le milieu de culture sont des paramètres importants à prendre en compte pour déterminer le meilleur protocole. En effet, il n’y a pas de protocole universel. La nature de la trypsine et son tampon, les conditions du protocole sont choisies selon les cellules et le milieu (milieu classique avec ou sans sérum).

Ce Techozyme reprend les points délicats de ce protocole couramment utilisé, mais dont l’optimisation est souvent  empirique.
LA DISSOCIATION DES CELLULES EN CULTURE A ADAPTER EN FONCTION DU TYPE DE MATRICE EXTRACELLULAIRE
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Seules les cellules adhérentes nécessitent d’être dissociées lors du repiquage.
Les cellules adhérentes qui poussent en tapis (ou monocouche) au contact de la boite de culture et des autres cellules développent des jonctions protéiques particulières qu’il faut détruire pour remettre les cellules en suspension dans un milieu frais lors de chaque passage (ou repiquage).
L’étape de dissociation peut être enzymatique (agitation avec ou sans un détergent doux) ou mécanique (grattoir), selon le niveau d’adhérence des cellules et leur sensibilité aux protéases.

Dans le cas de la dissociation enzymatique, on peut faire appel à la trypsine, une sérine-protéase, (seule ou en combinaison avec d’autres enzymes) ou à d’autres enzymes plus douces en présence d’une solution saline tamponnée.
Il faut savoir que l’utilisation de la trypsine peut être toxique pour certaines cellules :
•   Certaines lignées ont des contacts faibles qui ne nécessitent pas de dissociation enzymatique
•   D’autres lignées dérivant de l’épithélium ont des jonctions fortes impliquant plusieurs types de protéines de la matrice extracellulaire qui ne peuvent être éliminées que par une digestion enzymatique 

La trypsine est disponible sous forme d’extrait brut de pancréas de porc en solution. Ce type de préparation contient en fait d’autres protéases que la trypsine, des lipases et carbohydratases.
Le pH optimal pour l’activité de la trypsine varie entre 7,6-7,8 à 37°C.
Pour les cellules adhérentes résistantes et cultivées en milieu avec sérum, on doit quand même adapter le temps d’incubation avec la trypsine, et ce, en observant sous le microscope la progression du détachement des cellules (intervient généralement en 10 à 15 min maximum).
On doit aussi tenir compte que la trypsinisation peut aussi induire une internalisation de certaines protéines membranaires.
Les lignées dérivant d’épithélium peuvent exprimer aussi des cadhérines connues pour créer des jonctions adhérentes fortes calcium-dépendantes appelées desmosomes. Dans ce cas, l’ajout d’un chélateur du calcium comme l’EDTA peut être nécessaire pour les dissocier. Des lignées issues de cellules conjonctives (fibroblastes) ne développent pas ce type de jonction entre cellules et sont donc plus faciles à séparer.
POURQUOI UN MILIEU DE CULTURE SANS SÉRUM INFLUENCE-T-IL L’EFFET DE LA TRYPSINE SUR LES CELLULES ?
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Le sérum contient naturellement un inhibiteur de la trypsine (alpha2-macroglobuline et des facteurs d’attachement/adhérence cellulaire (fibronectine)). Un milieu sans sérum va donc rendre les cellules plus sensibles à la trypsine, on recommande par conséquent un protocole plus doux qu’avec un milieu classique avec sérum.
Le sérum étant un inhibiteur de la trypsine, il faut également laver les cellules avec du PBS avant la trypsinisation pour éliminer toute trace de sérum. Quand on rajoute sur les cellules du milieu frais contenant du sérum, on bloque naturellement l’action de la trypsine. Ce n’est pas le cas d’une culture sans sérum où l’on doit bloquer artificiellement son activité. En effet, la trypsine en absence de sérum est très agressive pour les cellules, décapant tous les récepteurs membranaires, absolument indispensables pour la réponse des cellules aux stimuli de croissance et de prolifération.
COMMENT ADOUCIR L’ETAPE DE TRYPSINISATION ?
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Dans le cas d’une culture en milieu sans sérum ou de cellules sensibles (cellules primaires et cellules souches) il est indispensable d’adoucir l’étape de trypsiniation et de contrôler les conditions pour maintenir une  bonne viabilité des cellules. Pour cela, il existe plusieurs approches :
Mieux contrôler l’activité de la trypsine :
En ralentissant la réaction enzymatique de la trypsine par une diminution de la température pendant l’étape de trypsinisation (par ex. travailler à température ambiante plutôt que 37°C).
Il existe aussi un protocole « à froid » dont l’optimisation porte sur la température d’incubation et la composition du tampon.

Ce protocole utilise de la trypsine-EDTA classique, du tampon Ultra Saline A et un inhibiteur de trypsine de la graine de soja.

L’avantage du tampon UltraSALINE A/trypsine /EDTA par rapport au DPBD/trypsine est qu’il contient de l’HEPES (qui a un meilleur pouvoir tampon) et du glucose,  qui ont un effet positif sur le maintien de la viabilité.
Changer d’enzyme : 
En remplaçant la trypsine naturelle purifiée de pancréas de porc par des enzymes plus douces :
Trypsine recombinante de bovin (TrypZean™ de LONZA) reconnue comme étant plus douce car plus pure (sans trace d’autre protéase comme la chymotrypsine issue de l’organe d’origine)
L’Accutase® est un cocktail d’enzymes qui fonctionne comme la trypsine, mais a l’avantage de s’autodétruire. En effet, sa température optimale pour fonctionner est de 25°C. Son activité diminue à 37°C et devient inactive en quelques minutes à 37°C. Elle est donc totalement inactivée dès la remise en culture à 37°C et ce sans ajout d’inhibiteur.

Bloquer l’activité des protéases (trypsine) après repiquage des cellules adhérentes (en absence de sérum)
Il est recommandé d’ajouter un inhibiteur de protéases dans le milieu de culture :
L’aprotinine à 0,1 ml/ml pour la trypsine purifiée de pancréas (spectre plus large, agit sur la trypsine et la chymotrypsine)
Autre solution, faire plusieurs lavages successifs suivis de centrifugation.
COMMENT RENFORCER L’ACTION DE LA TRYPSINE ?
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A l’inverse, on peut renforcer l’action de la trypsine en la combinant avec de la collagénase dans le cas de culture à haute densité et sur des cultures en multi-couches comme les fibroblastes.
On ajoute aussi couramment à la trypsine un agent comme l’EDTA (chélateur de cations divalents) pour renforcer son activité.
Le calcium et le magnésium présents dans la matrice extracellulaire aident l’adhésion entre cellules en protégeant les liaisons peptidiques sur lesquelles agit la trypsine. L’EDTA est ajouté pour retirer le calcium et le magnésium de la surface cellulaire et permet à la trypsine d’hydrolyser ces liaisons peptidiques.
Ces solutions trypsine/EDTA contiennent une concentration plus faible en trypsine que la trypsine seule 0,05% de trypsine en 1X et 0,5% en 10X au lieu de 0,25% et 2,5%.
En raison du rôle du calcium et du magnésium, on doit obligatoirement choisir une solution saline tamponnée sans calcium ni magnésium pour diluer la trypsine si on l’achète concentrée.
On peut aussi laver le tapis de cellules avec du DPBS sans calcium et magnésium pour retirer le maximum de sérum (inhibiteur de la trypsine) avant d’ajouter la solution de dissociation.
L’incubation à 37°C au lieu de la température ambiante augmente l’activité de la trypsine.
QUEL TAMPON DE TRYPSINISATION CHOISIR ET POURQUOI ?
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Conditions optimales pour l’activité de la trypsine : pH entre  7,6 et 7,8 à 37°C et concentration finale de 0,05% à 0,25%.
En effet, la concentration optimale de trypsine à utiliser pour une lignée donnée est la plus faible concentration qui permet de détacher les cellules et de les remettre en suspension dans une période courte (10 à 15 minutes d’incubation maximum).
Vérifier après repiquage que la lignée a bien les caractéristiques attendues : adhérence, temps de doublement, viabilité, morphologie …
La trypsine concentrée (10X) est fournie à 25 g/l soit 2.5%. Il convient donc de la diluer au moins 10 fois dans une solution saline tamponnée, habituellement de type PBS / DPBS (Dulbecco’s PBS) ou Earle’s BSS et Hanks'BSS.
On recommande toujours une formulation modifiée sans calcium ni magnésium.
A l’inverse, pour de l’immunofluorescence, on choisit une solution saline tamponnée avec calcium et magnésium pour conserver les jonctions cellulaires.
POINTS CRITIQUES DU PROTOCOLE :
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Conservation de la Trypsine
Une solution stock concentrée de trypsine se conserve à –20°C
Une solution diluée se conserve à 4°C pendant 2 semaines
La trypsine se dégrade si elle est stockée à température ambiante
Remarque :
Pour les repiquages, il faut utiliser un minimum de trypsine pour préserver les cellules :
•   Aspirer le surnageant
•   Laver les cellules avec 2 à 3 ml de trypsine diluée (+/- EDTA)
•   Aspirer immédiatement
•   Laisser agir le film de trypsine qui subsiste sur les cellules pendant quelques minutes. Au bout de  5 minutes, vérifier régulièrement le décollement des cellules (les cellules s’arrondissent). Puis, décoller les cellules en pipetant et diluer avec du milieu de culture (le sérum est un inhibiteur de la trypsine)
•   Si les cellules se décollent mal, on  peut rajouter quelques gouttes de trypsine sur les cellules et laisser agir à température ambiante ou à 37 °C, ou alors utiliser de la trypsine concentrée

Il faut respecter un ratio optimal entre le volume de trypsine/EDTA utilisé et le volume de milieu frais pour resuspendre les cellules (pour bloquer complètement la trypsine) :
Par exemple :
Volume de Trypsine/EDTA
•   Dans une flasque 25 cm2 ajouter approx. 1 ml
•   Dans une flasque 75 cm2, approx. 5 ml
•   Dans une flasque 175 cm2, approx. 10 ml
Volume de milieu frais
•   Dans une flasque 25 cm2, ajouter approx. 5-10 ml
•   Dans une flasque 75 cm2, approx. 10-30 ml
•   Dans une flasque 175 cm2, approx. 40-150 ml
LES PROBLÈMES FRÉQUEMMENT RENCONTRÉS ET SOLUTIONS PROPOSÉES
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Cellules difficiles à détacher :
•   Les inhibiteurs du milieu (sérum) ont inactivé les agents de dissociation.
Rincer le tapis de cellules 2 fois avec du DPBS sans calcium et magnésium avant d’ajouter la solution de trypsine, ou remplacer le DPBS du 1er rinçage par une solution de trypsine/EDTA.

•    La solution de dissociation n’est pas assez efficace.
Augmenter la concentration d’enzyme, d’EDTA ou ajouter d’autres enzymes (ex : dispase, collagénase). Ou incuber les cellules pour optimiser l’activité de la solution.

•    Les cellules ont été confluentes trop longtemps et les jonctions intercellulaires sont devenues trop fortes et empêchent la solution de dissociation d’atteindre l’interface substrat-cellule.
Il est préférable de repiquer à une confluence entre 70 et 90%. C’est d’ailleurs recommandé pour la viabilité des cellules comparée à une confluence de 100%.

Les cellules forment des agrégats après dissociation :
•   L’étape de dissociation a été excessive et des cellules lysées ont relargué de l’ADN génomique. Soit le pipetage a été trop violent ou la solution est trop efficace, voire toxique sur ces cellules (ex : pH ou osmolarité du tampon incorrects).

•   Ajouter une goutte de DNase stérile (1 mg/ml dans l’eau) aux cellules en suspension pour casser l’ADN. La prochaine fois, pipeter plus doucement les cellules, réduire la période d’incubation, utiliser une solution moins forte (concentration d’enzyme plus faible, sans EDTA, utiliser une enzyme plus douce) ou incuber à une température plus faible (température ambiante au lieu de 37°C ou protocole à froid (voir plus haut)).

•   Les cellules se sont agrégées avant la dilution et la dispersion dans le milieu frais.
Mettre la suspension de cellules sur la glace, s’il y a un délai avant d’ajouter le milieu frais (pour bloquer la trypsine qui continue d’agir jusqu’à l’ajout de sérum).

•    Les cellules ont été centrifugées trop brusquement ou trop longtemps au moment de retirer l’excès de solution de dissociation. Bien vérifier que vous utilisez une centrifugation douce (10 minutes à 125 × g).

Les cellules ne  ré-adhèrent pas à leur support :
•    L’étape de dissociation a été trop longue et a endommagé des protéines membranaires nécessaires à l’adhérence. Suivez pas à pas le décollement des cellules pour éviter une trop longue exposition à la trypsine.

•    Concentration insuffisante de sérum ou de facteurs d’attachement dans le milieu de culture (courant avec les milieux sans sérum). Ajouter des facteurs d’attachement dans le milieu ou « coater » la flasque avec ce type de protéines (collagène, poly-L lysine, fibronectine, gélatine, etc.).

•    La solution de dissociation n’a pas été inactivée ou retirée par centrifugation. Ajouter plus de sérum (volume de milieu frais plus important) ou d’inhibiteur d’enzyme  (ex: soybean trypsin inhibitor) pour neutraliser le milieu et centrifuger (5 minutes à 125 × g) les cellules dans la solution de dissociation et resuspendre en milieu frais.

La mortalité est plus importante que prévue
•   L’étape de dissociation a été trop forte.
•    Le pH ou l’osmolarité de la solution saline tamponnée est incorrecte. Vérifier-le ou changer de bouteille.
•    Les cellules détachées en suspension ont été laissées trop longtemps avant de réensemencer. Garder les cellules sur la glace.
•    Le milieu ne convient pas. Utiliser la formulation recommandée et vérifier qu’il contient tous les additifs nécessaires à la croissance.