TECHOZYME
COMMENT CONTRÔLER LA VIABILITÉ DE VOS CELLULES EN CYTOMÉTRIE EN FLUX ?
Les cellules analysées en cytométrie en flux après immunomarquage sont triées sur la base de l’expression de certaines molécules puis utilisées dans des tests fonctionnels (migration, cycle cellulaire, expansion clonale,…).

Evaluer le degré de mortalité cellulaire dans les analyses d’immunophénotypage est d’une importance capitale pour s’assurer que l’interprétation des données n’est pas biaisée, spécifiquement pour des phénotypes rares. Il est donc nécessaire d’incorporer un indicateur de viabilité cellulaire dans n’importe quel panel de cytométrie pour exclure les cellules mortes de l’analyse.

Dans ce TechOzyme, nous passons en revue les différents tests permettant de contrôler la viabilité des cellules en cytométrie en flux.
TESTS BASÉS SUR L’INTÉGRITE DE LA MEMBRANE PLASMIQUE DES CELLULES
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Compatibles avec les cellules non fixées :

Iodure de propidium (IP) : c’est un colorant cationique et un agent intercalant des acides nucléiques sans spécificité de base (réagit avec l’ADN ou l’ARN). Excité par le laser bleu (488 nm), il émet une fluorescence rouge (617 nm) quand il est lié à l’ADN. Son utilisation en cytométrie en flux est liée à sa lipophobie (ou hydrophilie) relativement élevée, qui l’empêche de traverser facilement les membranes plasmiques, sauf celles endommagées. Ceci fait de lui un puissant marqueur de la viabilité cellulaire. Dans le cas d’une cellule viable, l'IP ne peut pénétrer et se lier à l'ADN de la cellule, contrairement à une cellule morte qui présente une membrane perméabilisée/fragilisée.

7-aminoactinomycine-D (7-AAD) : il s’agit d’un colorant cationique comme l’iodure de propidium. Egalement excité par le laser 488 nm (bleu), son maximum d’émission de fluorescence est à 647 nm. C’est un analogue rouge fluorescent de l'actinomycine-D, avec laquelle il partage une forte affinité pour l'ADN. Le 7-AAD s'intercale entre les paires de bases GC de l'ADN. Cet agent étant peu ou pas pénétrant, seules les cellules dont l’intégrité de la membrane est compromise sont marquées. Cela permet ainsi la détection des cellules mortes ou des cellules en phase tardive d’apoptose. 

DRAQ7™ : c’est également un colorant de l'ADN qui émet dans le rouge profond (695 nm ou proche infra-rouge). Il ne pénètre pas dans les cellules viables ; il marque uniquement l'ADN des cellules mortes ou perméabilisées. Il représente une alternative idéale à l’iodure de propidium ou au 7-AAD, car il possède des propriétés spectrales intéressantes. En effet, il est excité par les lasers bleu, vert, ou rouge des cytomètres en flux et n’émet pas dans le canal de la phycoérythrine ou équivalents (aucune compensation avec PE, FITC). Il marque également très rapidement l’ADN nucléaire double brin des cellules mortes ou perméabilisées. On peut l’utiliser conjointement avec d’autres colorants de viabilité cellulaire. 
          En savoir plus sur le DRAQ7™

RedDot™ 2 : c’est un marqueur de l’ADN. De spectre similaire au DRAQ7™, il a aussi la particularité de pouvoir être excité par plusieurs types de laser et il émet dans le rouge lointain (maximum d’émission à 695 nm). Son pic d’émission de fluorescence est donc bien distinct de celui des autres fluorophores. Comme les colorants cités ci-dessus, il est incapable de pénétrer dans les cellules viables, car les membranes ne lui sont pas perméables. Ainsi, il permet de marquer sélectivement le noyau des cellules mortes.
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Compatibles avec les cellules fixées :

L’iodure de propidium et le 7-AAD sont des colorants communément utilisés en cytométrie en flux pour différencier les cellules mortes des cellules vivantes. Cependant, ils ne sont pas utilisables dans toutes les applications. En effet, pour la détection de cytokines ou d’antigènes intracellulaires, les cellules sont fixées avec un solvant organique dénaturant, comme le méthanol ou l’éthanol, pour favoriser l’accessibilité des cibles antigéniques. Or, ces solvants ont plusieurs effets :
          -  Ils dénaturent l’ADN et modifient l’affinité des colorants pour cet ADN
          -  Ils perméabilisent surtout les membranes de toutes les cellules.
L’iodure de propidium et le 7-AAD se liant de manière réversible à l’ADN des cellules perméabilisées, la discrimination entre les cellules mortes et les cellules vivantes est donc impossible dans le cas de cellules fixées.
TESTS BASÉS SUR LA PERTE D’ASYMÉTRIE DE LA MEMBRANE PHOSPHOLIPIDIQUE
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Les cellules viables présentent une membrane plasmique asymétrique. En effet, cette membrane cellulaire est formée d’une bi-couche lipidique dont certains composés sont normalement localisés uniquement sur la face interne. C’est le cas des phosphatidyl-sérines chargées négativement. Lors de l’entrée des cellules dans un processus de mort programmée ou apoptose, les résidus phosphatidyl-sérine sont transloqués sur le versant extracellulaire, aboutissant à une perte d’asymétrie de la membrane. L’annexine V est une protéine qui possède une forte affinité pour ces phosphatidyl-sérines, et couplée à des fluorophores comme le FITC, le PE ou l’APC, elle permet donc de détecter les cellules en phase d’apoptose précoce par cytométrie en flux. L’annexine V ne peut pas se lier aux cellules viables, celles-ci n’exposant pas de phosphatidyl-sérines à leur surface.
TESTS BASÉS SUR LE DOSAGE DE L’ACTIVITÉ CASPASE
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La viabilité cellulaire peut également être analysée en mesurant l’activité caspase des cellules en cytométrie en flux. Les caspases sont des protéases qui interviennent dans la mort cellulaire et dans le processus d’apoptose. La caspase-3 est une protéase clé dans l’apoptose ; elle clive la plupart des substrats connus à ce jour tels que DEVD. Ainsi, de nombreux kits sont basés sur le dosage de cette caspase. Une nouvelle classe de substrats fluorescents de la caspase-3, traversant les membranes des cellules et détectant l’activité caspase en temps réel, a été développée. Ces substrats sont composés de 2 parties ; une séquence DEVD (Asp-Glu-Val-Asp) spécifique (séquence clivée par la caspase-3) à laquelle est couplé un colorant fluorescent de l’ADN. Ces substrats non fluorescents et non fonctionnels au départ, traversent les membranes cellulaires pour entrer dans le cytoplasme des cellules. Ils sont alors hydrolysés par la caspase-3 libérant le colorant fluorescent à haute affinité pour l’ADN. Ce colorant migre ensuite vers le noyau pour le marquer.

Les tests de dosage de l’activité caspase-3 basés sur l’utilisation des nouveaux substrats bi-fonctionnels fluorescents correspondent aux kits NucView™ Caspase-3 (substrates ou assay kits) qui se déclinent en plusieurs versions en fonction du fluorophore (vert, NucView™ 488 / bleu, NucView™ 405 / orange, NucView™ 530).

Il existe également des kits incorporant 2 marqueurs apoptotiques, le substrat NucView™ 488 caspase-3 et l’annexine V couplée à un fluorophore CF™594,  CF™640R ou TexasRed®. Ces kits permettent d’étudier simultanément 2 événements importants de l’apoptose, que sont l’activation de la caspase-3 et la translocation des phosphatidyl-sérines.
LE SAVIEZ-VOUS ?
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Comment différencier les cellules apoptotiques des cellules nécrotiques ?
L'annexine V-FITC est utilisée en cytométrie en flux pour marquer les cellules en apoptose. Le test est basé sur l’exposition des phosphatidyl-sérines sur la face externe de la membrane plasmique. L'annexine V-FITC se fixe sur ces phosphatidyl-sérines, permettant ainsi de différencier les cellules apoptotiques des cellules vivantes. Cependant, lors de la nécrose, la membrane plasmique des cellules explose en partie ; elle devient poreuse et la cellule expose ainsi ses phosphatidyl-sérines au milieu extérieur. Les cellules en nécrose sont donc également marquées par l'annexine V-FITC. On réalise alors un second marquage avec de l'iodure de propidium (IP) ou du 7-AAD qui ne fixent les cellules que lorsque la membrane plasmique est poreuse. Autrement dit, l'IP ou le 7-AAD peuvent marquer les cellules en nécrose car la membrane est perméable, mais pas les cellules apoptotiques car la membrane reste imperméable.
L’utilisation conjointe des deux marqueurs Annexine V et IP/7-AAD permet donc de différencier les cellules vivantes (Annexine V et IP/7-AAD négatives), des cellules en apoptose précoce (Annexine V positives, IP/7-AAD négatives) et des cellules en nécrose (Annexine V positives, IP/7-AAD positives). Il en est de même pour l’utilisation conjointe du NucView™ 488 et du RedDot™2 (Kit  disponible : NucView™ 488 and RedDot™ 2 Apoptosis & Necrosis Kit

Pourquoi n’est-il pas recommandé d’utiliser le kit de dosage de l’activité caspase-3 NucView™ 488 avec l’iodure de propidium ?
En cytométrie en flux, NucView™ 488 émet beaucoup de fluorescence dans le canal de l’iodure de propidium et la compensation est complexe. Pour cette raison, il est plutôt recommandé de combiner le NucView™ 488 avec le 7-AAD ou le RedDot™ 2, des colorants qui ont des émissions plus lointaines.