TECHOZYME
ACCÉLÉREZ VOS RECHERCHES GRÂCE À LA PCR DIRECTE
RÉUSSIR VOS PCR SANS PURIFIER L’ADN, C’EST POSSIBLE !
La PCR est généralement réalisée sur de l’ADN purifié, car des inhibiteurs sont fréquemment présents dans les échantillons bruts. La première PCR directe sur des échantillons bruts a été réalisée sur des colonies de bactéries sous le nom de « PCR sur colonie » en 1989 par L.I. Zon et al (1). Depuis, en raison de  sa rapidité et de sa simplicité, différentes approches en PCR directe ont été validées sur des échantillons très variés, y compris sur du sang ou des tissus conservés en FFPE.
Dans ce TechOzyme, nous développons les sujets portant sur les contraintes techniques de la PCR directe, les solutions ainsi que les applications.
PCR DIRECTE : QUELLES SONT LES BARRIÈRES À FRANCHIR ?
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Les inhibiteurs et leur mode d’action
La PCR est une technique sensible et puissante, mais la présence d’inhibiteurs dans le mélange réactionnel modifie le rendement et la spécificité de la PCR. Il existe deux catégories d’inhibiteurs :
•   Les inhibiteurs naturels, substances naturellement présentes dans les échantillons
•   Les inhibiteurs synthétiques, introduits lors de la préparation d’ADN en amont
Les inhibiteurs de PCR les plus courants, ainsi que leur origine sont décrits dans le tableau 1.
Les inhibiteurs de PCR agissent principalement sur deux cibles, l’ADN polymérase thermostable et la matrice d’ADN. La structure de l’ADN polymérase peut être modifiée lorsqu’elle est en contact avec un inhibiteur, rendant inaccessible son site actif et réduisant voire supprimant son activité enzymatique. La dégradation de l'ADN polymérase peut également avoir lieu en présence de certains inhibiteurs.

D’autres inhibiteurs peuvent induire la déstabilisation ou la stabilisation des interactions ADN-polymérase ou matrice-amorce. Tout cela modifie la spécificité d’hybridation des amorces et impacte directement le rendement de la PCR.

La préparation des échantillons
La préparation des échantillons est une étape importante. En effet, pour que la PCR directe fonctionne, l’ADN doit être « libéré » dans le tampon de réaction. Des méthodes physiques (ex. chauffage à haute température), chimiques (ex. lyse à la soude) ou enzymatiques (ex. traitement par la protéinase K) sont utilisées pour préparer des extraits d’ADN. Le choix de la méthode se fait selon l’échantillon. Plusieurs méthodes peuvent être utilisées simultanément, mais aucune solution n’est universelle.
LES POINTS IMPORTANTS POUR RÉUSSIR LA PCR DIRECTE
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Enzyme et tampon de PCR :
L’enzyme, pour la PCR directe, doit être résistante aux inhibiteurs. Les cofacteurs de la polymérisation comme le facteur de fixation à l’ADN ou des modifications de l’ADN polymérase sont des méthodes efficaces pour augmenter la robustesse de l’enzyme. Aussi, certaines enzymes de PCR sont plus résistantes aux inhibiteurs que d’autres, comme par exemple la Tth DNA polymerase (2,3)
Les optimisations de tampon de réaction sont également importantes.  Elles permettent d’atténuer les effets des inhibiteurs sur la polymérase et/ou sur l’ADN (matrice, amorces) et améliore ainsi l’efficacité de la polymérase.

Les échantillons
   Libération de l’ADN par chauffage à haute température :
C’est la méthode la plus rapide et la plus simple, car il suffit de prolonger la durée de la dénaturation initiale de la PCR qui est généralement à 95°C - 98°C. Elle est adaptée aux expériences où un grand nombre d’échantillons sont à analyser. En revanche, elle ne convient pas à tous les types d’échantillons et la quantité de départ doit être faible. Retrouvez les recommandations pour cette méthode dans le tableau 2.
Cette méthode ne permet pas de réutiliser les échantillons. Les méthodes de lyse chimiques ou enzymatiques sont recommandées dans ce cas.
•   Lyse chimique :
Une solution de soude NaOH 50 mM est ajoutée aux échantillons qui sont ensuite incubés à 95°C pendant environ 10 minutes. Les lysats obtenus sont neutralisés par l’ajout de Tris-HCl (pH 8.0) à 1 M. Une aliquote du lysat est prélevée pour la PCR directe.
Cette méthode est généralement utilisée pour les échantillons de tissus d’animaux de quantité plus importante (5 à 10 mg ou plus). De plus, il est possible de conserver les lysats pendant plusieurs mois.
•   Lyse enzymatique :
La protéinase K est utilisée pour digérer les échantillons de tissus. La durée de digestion est plus ou moins longue suivant les tissus. Des solutions optimisées et prêtes à l’emploi sont disponibles comme les « Lysis Buffers » de Viagen. Cette méthode est compatible avec des échantillons en grande quantité, mais la durée de traitement est plus longue, pouvant aller jusqu’à une nuit. Comme la lyse chimique, une aliquote de lysat est utilisée et il est possible de conserver les lysats pendant quelques mois.
Les échantillons liquides comme le sang, l’urine … sont également utilisés avec succès dans la PCR directe. Et aucune lyse n’est nécessaire au préalable. Certains kits de PCR directe tolèrent une concentration de sang jusqu’à 20 à 40% du volume total réactionnel.
QUESTIONS FRÉQUEMMENT POSÉES
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Pourquoi ajouter la protéinase K avant de déposer les produits de PCR sur gel ?
Quand des tissus d’animaux sont utilisés pour la PCR directe, les ADN amplifiés peuvent être piégés par des débris de cellules donnant une migration incorrecte dans le gel d’électrophorèse. La protéinase K permet de digérer ces débris cellulaires et les ADN amplifiés migrent correctement.

Peut-on utiliser du sang ou des tissus pour la qPCR directe avec la sonde SYBRGreen ?
Non, car ce type d’échantillon a une activité importante d’extinction de la fluorescence du TB Green. Pour cela, nous vous conseillons d'utiliser le SensiFAST™ Probe Direct SuperMix et les sondes TaqMan®, Scorpions® ou molecular beacon. 

Références bibliographiques 
L.I. Zon, D.M. Dorfman, and S.H. Orkin,The polymerase chain reaction colony miniprep. Biotechniques, 1989. 7(7):696-698.

K. Davalieva, G. D. Efremov. Influence of salts and PCR inhibitors on the amplification capacity of three thermostable DNA polymerase. Macedomian Journal of chemistry and chemical engineering, Vol. 29, No. 1, pp 57 – 62 (2010).

W. Abu Al-Soud and Peter Radström. Capacity of nine thermostable DNA polymerase to mediate DNA amplification in the presence of PCR-inhibiting samples. Applied and Environmental Microbiology. Vol. 64, No. 10, P. 3748 – 3753, (1998).
SOLUTIONS OZYME POUR LA PCR DIRECTE
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Taq’ozyme Purple Mix 2  - Criblage de colonies < 5 kb ADNg  
Plus d’infos        

 
Taq’Oyzme HS  - Lysats de queues de souris < 5 kb ADNg    


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