TECHOZYME
COMMENT PASSER À L’IHC MULTIPLEXE (MIHC) ?
L’IHC est une technique initialement développée pour la détection colorimétrique de protéines sur coupes de tissus par un anticorps couplé à une enzyme (généralement HRP : horseradish peroxidase) qui dégrade un substrat non coloré en un précipité coloré (le plus courant DAB : 3,3’-diamino benzidine) combinée généralement à un contre-marquage avec une coloration du noyau (fréquemment l’hématoxyline :…coloration bleue). D’autres enzymes, substrats chromogènes et colorants peuvent également être utilisés mais sont beaucoup moins courants et sont peu utiles en mono-marquage.

On peut être tenté par un marquage multiple ou multiplex IHC (mIHC) pour détecter sur une même coupe plusieurs protéines d’intérêt ainsi que le noyau. En effet le multiplexage permet de faire plusieurs marquages simultanément sur un même échantillon, ce qui est très intéressant pour des échantillons précieux. De plus, il est toujours préférable d’observer l’ensemble des cibles sur une même coupe car on se situe ainsi sur un même plan d’observation.

Ce TechOzyme détaille les différentes stratégies d’IHC multiplexe : classiques en colorimétrie et également celles plus innovantes en fluorescence à l’aide d’haptènes et de tyramides fluorescentes.
IHC multiplexe en colorimétrie
LES PRÉREQUIS
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Pensez aux contrôles
Comme pour de l’IHC simplexe, on préfère des anticorps validés par le fournisseur pour cette application (sensibilité, spécificité, reproductibilité), et dont les conditions optimales sont clairement définies (conditions de démasquage de l’antigène, fixation, tampon de dilution d’anticorps).  Comme pour toute expérience on devra définir des conditions témoins de contrôle positif et négatif (tissus dans lesquels la cible est soit fortement exprimée ou pas du tout ; tissus différents ou préalablement traités).
En complément, il est recommandé d’utiliser des lames contrôles validées pour son anticorps d’intérêt , certaines sont disponibles chez Cell Signaling Technology ou bien préparer soi-même des tissus contrôles choisis d’après des publications ou sur le site du Human Protein Atlas (www.hpa.com) qui cartographie l’expression de 35000 protéines humaines et souris dans des tissus sains et cancéreux.
Cell Signaling Technology et Atlas Antibodies propose aussi des peptides bloquants qui se lient spécifiquement à l’anticorps contre lequel ils ont été désignés et bloquent la fixation de l’anticorps à sa cible. Cela permet de confirmer la spécificité et d’éliminer les questions concernant une fixation non spécifique de l’anticorps.



Protocole : séquentiel ou simultané ?
Cette technique a été développée en colorimétrie pour détecter jusqu’à 3 à 4 cibles simultanément. Et dans ce cas on doit choisir ses anticorps et son niveau d’amplification comme pour l’immunofluorescence en multiplexe et adapter un protocole séquentiel ou simultané. Pour en savoir plus, lire le TechOzyme sur l’IF.
Choisissez une détection de dernière génération
De manière générale, en multi-marquage, on diminue au maximum le nombre d’étape pour chaque marquage; notamment en remplaçant la technique de détection ABC ou dérivée par une détection par anticorps couplé à un polymère HRP n’utilisant pas la streptavidine /biotine polymère (Signalstain® Boost IHC detection reagent #HRP-lapin #8114S ou HRP-souris#8125S). Ceci élimine la ou les étape(s) de blocage des biotines endogènes (notamment dans certains tissus comme le foie, le rein, la rate …) et une des sources de bruit de fond. En savoir plus sur les étapes de blocage, lire le TechOzyme sur l’IHC
Optez pour un ordre de marquage adapté aux antigènes à détecter
L’IHC multiplexe est possible quand les antigènes sont localisés dans différents types cellulaires de la coupe de tissu ou dans différents compartiments cellulaires d’une même cellule. Dans le cas de deux antigènes colocalisés dans le même compartiment de la même cellule, on préférera les techniques d’immunofluorescence. En effet, après l’apparition du premier précipité chromogénique, le compartiment risque d’être saturé et devient très difficile à marquer correctement avec un second colorant.
Il est impératif de valider chaque mono-marquage individuellement avant de passer au multiplexage qui va servir de contrôles au multi-marquage.
Il faut donc vérifier que l’encombrement stérique n’affecte pas le marquage du second antigène dans un double marquage et ainsi de suite. Dans le cas de marquage séquentiel, on devra donc tester plusieurs ordres de marquage et s’assurer que l’intensité des multi-marquages est identique à ceux obtenus en mono-marquage. Ainsi par exemple, des antigènes nucléaires sont généralement mieux marqués avant le marquage des antigènes cytoplasmiques et,  des antigènes de la membrane cellulaire sont souvent mieux marqués avant le marquage des antigènes cytoplasmiques.
CHOIX DES COUPLES ENZYMES/SUBSTRATS CHROMOGÉNIQUES
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Le marquage multiple de plusieurs antigènes sur la même coupe de tissu nécessite l’utilisation de systèmes de détection ayant une grande sensibilité et générant peu de bruit de fond. De même, le choix des enzymes et de leurs substrats va déterminer le meilleur rendu de couleur en termes de contraste. Il existe de nombreux substrats colorés pour optimiser une procédure de marquage multiple.

Le choix, la combinaison des enzymes et des substrats dépendent de nombreux facteurs :
-La sensibilité/intensité du précipité d’un substrat
-La stabilité dans le milieu de montage
On peut faire le choix :
d’une seule enzyme avec plusieurs substrats pour détecter plusieurs antigènes
ou d’une enzyme différente avec son propre substrat pour chaque antigène
Les enzymes couramment utilisées seules ou en combinaison sont l’enzyme peroxydase HRP (« horseradish peroxidase » ou peroxydase du raifort) et l’AP (« alkaline phosphatase » ou phosphatase alcaline).
La béta-galactosidase (Gal) ou le glucose oxydase (Gox) peuvent aussi être utilisés pour des triples marquages. Si certains anticorps secondaires couplés à ces enzymes sont plus rarement disponibles commercialement, on peut les coupler soi-même avec les kits Mix-n-Stain™ HRP, PA, Gox.

On peut aussi coupler des anticorps primaires pour un marquage direct.
En général les substrats de la peroxydase produisent des précipités plus denses, plus fins avec une localisation précise.
Les substrats de la phosphatase alcaline donnent un précipité plus diffus et plus transparent que ceux de la peroxydase.
Tous les substrats ne donnent pas la même sensibilité : l’AEC (3-Amino-9-Ethylcarbazole) est moins sensible que le DAB (3,3'-diaminobenzidine) avec ou sans enhancer métallique (Ni/Co). Le TMB est le plus sensible des substrats de la peroxydase mais le précipité obtenu est plus diffus et moins localisé, il n’est pas recommandé pour les multi-marquages bien qu’il soit intéressant en cas de protéine antigénique faiblement exprimée.

BLOCAGE DE L’ACTIVITÉ ENZYME ENDOGÈNE POUR ÉVITER LE BRUIT DE FOND
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L’utilisation d’une enzyme nécessite aussi d’inhiber l’activité de l’enzyme endogène pour optimiser le contraste et réduire au maximum le bruit de fond. Pour la peroxydase : les tissus/cellules connus pour contenir cette activité sont les globules rouges, les granulocytes, les éosinophiles, les monocytes, les hépatocytes, les muscles et les reins.

Pour la phosphatase alcaline : ce sont le placenta, l’intestin, les ostéoblastes dans les os, les reins, les tissus lymphoïdes, les cellules endothéliales des capillaires et artères, les neutrophiles, et les cellules stromales réticulaires.
Il existe des étapes de blocage spécifique de ces enzymes endogènes:
- La peroxydase se bloque avec du peroxyde d’hydrogène (eau oxygénée) en solution dans l’eau ou le méthanol.
- La phosphatase alcaline existe sous deux formes : intestinales et non intestinales. Dans le cas de l’enzyme non intestinale, le blocage est possible avec le levamisole qui est un inhibiteur de l’enzyme (à ajouter au tampon au moment de la préparation du substrat). Dans le cas de l’enzyme intestinale, l’inhibition peut se faire par un traitement à l’acide acétique ou à l’acide périodique et borohydrate de potassium avant marquage.
En général la phosphatase alcaline endogène est détruite lors de la fixation au formol, et aucun blocage spécifique n’est nécessaire. Ces réactifs peuvent s’acheter seuls ou comme composant de kits complets de détection.
CHOIX DU CONTRE-MARQUAGE
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La plupart des cellules sont incolores et transparentes, il peut donc être difficile d’identifier le type cellulaire et la localisation du marquage. C’est pour cette raison que l’on utilise un contre-marquage. Ce marquage se fait après le marquage par l’anticorps juste avant le montage. Il permet de localiser le marquage par rapport aux compartiments cellulaires et permet de contraster la coupe. Le colorant le plus courant est l’hématoxyline (#14166S) . En fait c’est le produit d’oxydation de l’hématoxyline qui est le colorant. Il est couplé à un mordant positivement chargé qui se lie à la chromatine chargée positivement. Il colore ainsi les noyaux des cellules mammifères en bleu en fixant les résidus lysine des histones nucléaires, contrairement à d’autres colorants du noyau qui ciblent les acides nucléiques, comme le vert de méthyl ou le bleu de méthylène.
Le vert de méthyl est un colorant du noyau bleu/vert qui a la particularité de distinguer ADN et ARN dans les tissus quand il est utilisé en combinaison avec la pyronine. La pyronine colore l’ARN et le vert de méthyl l’ADN.

Le bleu de toluidine marque le noyau en bleu foncé et colore aussi les polysaccharides en rose/rouge.

L’éosine peut être utilisée pour colorer le noyau en rose.
Il faut également adapter le milieu de montage à la nature du contre-marquage utilisé, selon qu’il est soluble dans l’alcool on non, et donc choisir un milieu de montage compatible avec les différents substrats et le contre-marquage.

On doit également associer le bon contre-marquage en fonction de la couleur des substrats chromogéniques. Voir tableau des combinaisons
CHOIX DU MILIEU DE MONTAGE
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Après l’étape d’immuno-marquage, les milieux de montage sont utilisés pour faire adhérer la lamelle à la coupe de tissu ou aux cellules étalées. Il est important car il protège l’échantillon et le marquage. Il joue aussi un rôle en améliorant la netteté et le contraste de l’image pendant l’observation au microscope.

Il y a deux catégories de milieux de montage : organique et aqueux (ou respectivement hydrophobe et hydrophile) :
Un milieu de montage organique - dit permanent - doit être utilisé uniquement pour des marquages enzymatiques donnant un précipité insoluble dans les solvants organiques (comme le DAB).
Les milieux de montage aqueux sont utilisés pour tous les chromogènes.

Nous proposons ces 2 types de milieu de montage :
Aqueux

Les meilleures combinaisons pour le multi-marquage pour un niveau de contraste optimal sont les suivantes :
Combinaison pour double marquage + contre-marquage
Brun/rouge :  AP/Fast red/Rouge, HRP/DAB/Brun, contre-marquage hématoxyline/Bleu
Turquoise/rouge : Gal/X-Gal/Turquoise, AP/Fast red/Rouge, contre-marquage vert de méthyl
Bleu-rouge : HRP/DAB/Brun, Gal/X-Gal/Turquoise, AP/Fast red/Rouge
HRP/DAB/Brun, AP/New Fucsin/Rouge, HRP/TMB/Vert
Combinaison pour triple marquage
Gal/X-Gal/Turquoise, AP/Fast blue/Bleu, HRP/AEC/Rouge
HRP/DAB/Brun, Gal/X-Gal/Turquoise, AP/Fast red/Rouge
HRP/DA P/Brun, AP/New Fucsin/Rouge, HRP/TMB/Vert

« Mouse-on-mouse »
Si vous travaillez sur des tissus de souris, avec des anticorps primaires faits chez la souris vous pouvez obtenir un bruit de fond « souris sur souris » (mouse-on –mouse). Les secondaires utilisés dans ce cas seront des anti- souris qui reconnaitront le primaire mais aussi des IgG naturellement présents dans le tissu étudié ou les récepteurs de surface des cellules reconnaitront la partie Fc de l’anticorps secondaire.
Le multiplexage complique le choix des anticorps à utiliser, en raison du bruit de fond. Privilégier si possible  des primaires faits dans une autre espèce comme le lapin, des secondaires  IgG F(ab) ou F(ab’)2, ou des primaires directement marqués (détection directe à utiliser uniquement si la protéine cible est fortement exprimée). Malheureusement le multiplexage implique fréquemment d’utiliser des primaires de sources différentes ; nous verrons plus loin que la fluorescence par les haptènes ou les tyramides permet d’y remédier.
IHC multiplexe en fluorescence
POURQUOI PASSER À LA FLUORESCENCE ?
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Une des solutions aux nombreux problèmes rencontrés pour réaliser de l’IHC multiplexe est de passer de l’IHC chromogénique à l’IHC en fluorescence.
Cela permet d’augmenter le niveau de multiplexage au maximum de 4 à 6 (5 + ADN) et de plus facilement détecter des protéines exprimées dans le même compartiment cellulaire, mais cela exige de travailler avec un microscope à fluorescence, et se préoccuper de l’autofluorescence émise. Voir TechOzyme IF pour éliminer l’autofluorescence)
On utilisera aussi un milieu de montage pour l’IF (pour conserver la fluorescence) et un colorant ou un bio-conjugué fluorescent pour le contre-marquage.
Table comparant l'IHC multiplexe en fluorescence et chromogénique
Actuellement plusieurs stratégies d’IHC multiplexe en fluorescence sont développées :
Par des protocoles de marquage en parallèle :
En fluorescence directe avec des anticorps primaires directement couplés qui permet de travailler avec plusieurs primaires d’une même espèce mais dans ce cas il n’y a pas d’amplification de signal et cela n’est adapté qu’aux cibles fortement exprimées.
En fluorescence indirecte avec des secondaires conjugués à des fluorophores cela nécessite d’avoir des secondaires d’espèces différentes ou d’isotypes différents et permet une amplification modérée.
Par des protocoles de marquage en série :
En fluorescence indirecte avec des primaires conjugués à des haptènes
En fluorescence indirecte avec des secondaires-HRP avec comme substrat des tyramides conjuguées à des fluorophores qui vont se déposer sur l’échantillon à l’emplacement de l’antigène et permettre d’utiliser des primaires de même espèce sans réaction croisée des secondaires, avec un niveau d’amplification important.
LA TECHNIQUE INDIRECTE UTILISANT DES HAPTÈNES - LA DIGOXYGENINE ET LA BIOTINE - AVEC 3 PRIMAIRES D’UNE
MÊME ESPÈCE
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Un haptène est une petite molécule qui déclenche une réponse immunitaire uniquement s’il est conjuqué à une plus grosse molécule comme une protéine (protéine carrier). On peut choisir la biotine et la digoxygénine.

Cette technique permet de faire un triple marquage, plus un contre-marquage :
- une 1ère  cible avec un primaire et un secondaire « classique » conjugué à un fluorophore
- une 2nde cible avec un primaire biotinylé reconnu par une streptavidine couplée à un second fluorophore
- et, une 3ème cible avec un primaire conjugué à la digoxygenine (DIG) et un secondaire anti-DIG conjugué à un fluorophore.
Triple marquage en mIHC en fluorescence avec des haptènes
Les 3 primaires peuvent être issus de la même espèce. Ce protocole est un mélange de protocole  en parallèle et en série ; en effet la 1ère  cible est marquée, puis les 2ème et 3ème cibles sont marquées en simultané ce qui raccourcis le protocole notamment par rapport à un protocole complètement en TSA® (Voir paragraphe suivant). Il faut penser à bloquer la biotine endogène des tissus avec ce protocole (Voir le TechOzyme IHC).

Le dinitrophenol (DNP) est aussi utilisé comme haptène. Il existe des kits de conjugaison d’anticorps Mix-n-Stain™ avec des fluorophores variés (CF™ Dyes, FITC…) et des kits Mix-n-Stain™ biotine, digoxygénine  et DNP pour conjuguer ses primaires. Des anticorps anti-haptènes sont également disponibles.
Liste des produits (kits de conjugaison et anti-hapten)  : Contacter le support technique
LA TECHNIQUE TSA® (TYRAMIDES CONGUGUÉE À DES FLUOROPHORES)
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Cette technique est intéressante car elle permet de travailler avec un large panel d’anticorps primaires et secondaires sans réaction croisée. En effet, chaque mono-marquage est réalisé indépendamment des autres. Les marquages sont réalisés en série et entre chaque marquage les anticorps utilisés sont décrochés par un passage aux micro-ondes tout en préservant la marquage. Cette technique utilise un primaire non marqué, lui-même reconnu par un secondaire –HRP. C’est le substrat utilisé qui rend cette technique singulière car le substrat de l’enzyme HRP n’est pas transformé en colorant comme en IHC chromogénique. L’HRP va catalyser le dépôt de molécules de tyramides conjuguées à un fluorophore. Puis, les tyramides activées se fixent de manière covalente aux résidus tyrosine de l’antigène/cible ou des protéines du voisinage proche. On peut ainsi décrocher les anticorps  en préservant la fluorescence associée à l’antigène (voir schéma du principe de base de Cell Signaling Technology). Cette technique permet de faire 5 marquages, plus un contre-marquage.
Schéma de la technique TSA (tyramides conjuqués à des fluorophores
La mise en place de cette technique demande certaines optimisations au niveau de la concentration des anticorps, du choix des couples antigène-fluorophore et de l’ordre des différents marquages.
Cell Signaling Technology (CST) a développé cette approche pour la mIHC pour l’étude des protéines des immune checkpoints et décrit en détail les optimisations nécessaires pour un multi-marquage sur 5 cibles (CD8 alpha, PD-L1, B7H4, FoxP3, Cyto-kératine) et avec un contre-marquage DAPI. CST utilise les kits TSA® de Perkin Elmer (cyanines, FITC ;..) et de ThermoFisher (Alexa Fluor®). L’anticorps secondaire utilisé est un secondaire HRP polymère qui augmente encore le niveau d’amplification par rapport à un secondaire HRP classique, car l’anticorps est conjugué à plusieurs molécules d’HRP par l’intermédiaire du polymère (Signalstain® Boost IHC detection reagent #HRP-lapin #8114S ou HRP-souris#8125S).


Deux kits optimisés de multiplexe IHC pour faire des triples marquages utilisant à la fois un secondaire HRP-polymère sont disponibles (Signalstain® Boost IHC detection reagent #HRP-lapin #8114S ou HRP-souris#8125S) et les tyramides conjuguées à des fluorophores  pour une amplification maximale du signal.

Points importants pour les optimisations :
Concentration des anticorps primaires : la dilution idéale de chaque anticorps primaire doit être déterminée empiriquement et elle diffère souvent et significativement des dilutions de ce même anticorps en IHC simplexe chromogénique (dilution augmentée d’un facteur 100 à 200 en général). Une titration doit être faite pour chaque composant du panel avec un fluorophore de moyenne intensité.
L’ordre des marquages doit être optimisé : il faut vérifier que l’ordre n’affecte pas un marquage (chauffages successifs qui peuvent endommager un antigène et modifier la spécificité de reconnaissance de l’anticorps pour l’épitope).
Choix du couple anticorps-fluorophore : on recommande de coupler les anticorps reconnaissant des cibles faiblement exprimées avec les fluorophores les plus brillants. Il convient donc de tester les différents couples possibles pour obtenir la meilleure intensité de signal avec le meilleur rapport signal/ bruit de fond pour chacune des cibles.
Des tyramides conjuguées à d’autres types de fluorophores (les CF™ Dyes) sont également disponibles. Les CF™ Dyes offrent un très large panel de longueur d’ondes de l’UV au proche infra-rouge avec une stabilité et une brillance inégalée.

Cette technique est à réserver aux coupes de tissus FFPE car des cellules ne supporteraient pas les étapes de décrochage des anticorps aux micro-ondes. Certains tissus peuvent ne pas supporter cette étape et modifier leur morphologie ; dans ce cas on peut adopter d’autres stratégies en mélangeant la technique indirecte TSA® pour une cible faiblement exprimée avec une détection directe pour une autre cible fortement exprimée ou avec une détection indirecte par un secondaire-HRP « classique ». Cette technique se limite à 2 antigènes avec des primaires de la même espèce. Comme le primaire détecté par la technique TSA® est très dilué, il est reconnu par le secondaire « classique » HRP  comme le primaire du second antigène mais le niveau de signal de fluorescence est indétectable.


La tendance actuelle est d’aller vers la fluorescence qui permet un niveau de multiplexage plus important.