TECHOZYME
CE QU’IL FAUT SAVOIR POUR CHOISIR SON ANTICORPS SECONDAIRE
ET L’UTILISER DANS DES CONDITIONS OPTIMALES
Il est essentiel d’identifier les nombreux paramètres qui affectent la spécificité, la sensibilité et la reproductibilité des anticorps secondaires.
Les anticorps secondaires sont utilisés couramment comme réactif de détection dans de nombreux types d’expériences (Western blot, IHC ou l’imagerie cellulaire). Mais trop souvent le choix de l’anticorps secondaire est négligé et l’impact sur l’expérience est tout aussi négatif que de sélectionner un mauvais anticorps primaire.
Les anticorps secondaires, comme tous les anticorps, sont définis pour reconnaitre un antigène spécifique. Par définition, l’anticorps secondaire reconnait les immunoglobulines de l’anticorps primaire et sert de réactif de détection dans les immuno-essais. Ainsi,  les facteurs à prendre en compte pour sélectionner un anticorps primaire pour une expérience s’appliquent aussi au choix d’un secondaire.
Choisir le bon anticorps secondaire pour votre expérience aura un impact positif sur vos résultats et inversement si le choix du secondaire est mauvais.

Voici 3 paramètres essentiels pour déterminer les performances d’un anticorps :
.   La spécificité
.   La sensibilité
.   La reproductibilité

Nous allons détailler chacun de ces paramètres et leur impact sur la réussite de votre expérience.
La plupart du temps, il n’existe pas de secondaire universel utilisable pour toutes vos expériences de WB, IHC et ELISA, même si le système de détection utilise la même enzyme pour la détection (ici l’HRP). On doit tenir compte de la nature de l’échantillon, de l’espèce en jeu, du système de détection (incluant le substrat), du système d’amplification utilisé, du bruit de fond observé. Chaque détail de l’expérience nous permettra de sélectionner ou d’écarter certains anticorps secondaires.
QUELLES SONT LES DIFFÉRENTES PARTIES COMPOSANT LA STRUCTURE DE L’ANTICORPS SECONDAIRE ?
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Nature et origine de l’anticorps

L’anticorps secondaire reconnait les immunoglobulines de l’espèce du primaire utilisé.
L’anticorps secondaire est généralement un anticorps polyclonal fabriqué dans des espèces comme la chèvre, l’âne, le cheval et le mouton plutôt que la souris, le rat et le lapin. Mais le panel d’espèces source peut être plus large avec le poulet, le lama…

L’anticorps secondaire peut être :
.   Un IgG complet (noté (H+L) : c'est-à-dire un anti-IgG [chaine lourde (=Heavy chain) et légère (= Light chain)]
.   Ou une partie d’IgG : F(ab), F(ab’)2

Certains types cellulaires ou organes (ex. monocytes, macrophages, lymphocytes B, thymus ou rate,…) présentent de nombreux récepteurs Fc à leur surface qui réagissent avec les immunoglobulines de souris ou de lapin générant un marquage aspécifique. Ces récepteurs Fc peuvent être bloqués par une incubation avec des immunoglobulines provenant de l’espèce des cellules étudiées avant l’immuno-marquage. Une autre solution consiste à utiliser des anticorps secondaires IgG F(ab)'2 purifiés par affinité pour éviter la fixation de la partie Fc aux récepteurs Fc des cellules vivantes.

Réactivité de l’anticorps (espèce et type d’Ig)

En général, on utilise un anti-IgG  (H+L). Si vous utilisez un anticorps primaire produit chez le lapin, vous choisirez un anti-lapin produit dans une autre espèce que le lapin. On trouve aussi des secondaires qui ne reconnaissent qu’une fraction d’IgG : anti-Fc, anti F(ab), anti chaine lourde, légère.

Pour comprendre, il faut connaitre la structure d’une IgG présentée ci-dessous :
Structure d'un anticorps IgG
On peut également utiliser des secondaires dirigés contres des classes ou des sous-classes d’immunoglobulines :
Classes et sous-classes d’immunoglobulines
Ces catégories permettent de distinguer des primaires de même espèce mais de nature différente (très utile en multi-marquage lorsque les primaires sont de la même espèce).
PURIFICATION DE L'ANTICORPS
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Les niveaux de purification disponibles sont les suivants :
.   Sérum brut

.   Fraction d’IgG : toutes les IgG de l’animal immunisé sont récupérées à partir de son sérum (les spécifiques et les non spécifiques). Cette purification est
    souvent réalisée avec les protéines A, G ou L. Ces protéines d’origine bactérienne ont une forte affinité pour les anticorps et sont capables, quand elles sont
    fixées à une résine, de retenir  plus ou moins certaines classes ou sous-classes d’immunoglobulines.

.   Purification par affinité : on ne conserve que les IgG dirigées contre l’antigène qui a servi à immuniser l’animal. L’antigène est immobilisé sur une résine de
    chromatographie et ne va retenir que les anticorps dirigés contre cet antigène. Ce type d’anticorps est bien évidemment plus spécifique que les fractions d’IgG.

.   Purification par affinité plus adsorption croisée (très utile en IF pour minimiser le bruit de fond)

Les anticorps cross-adsorbés contre d’autres espèces peuvent être notés de la manière suivante :
« min x w/human, mouse and rabbit IgG/serum proteins » ce qui signifie qu'ils ont été cross-adsorbés contre des IgG ou des protéines du sérum humain, souris et lapin. Ces anticorps permettent de travailler sur une coupe de tissu humain avec un primaire de souris et un primaire de lapin.

Le bruit de fond observé en IF est souvent issu de réactions croisées des anticorps utilisés.
Une « réaction croisée » est une réaction obtenue lorsqu’un anticorps dirigé contre une espèce reconnait une autre espèce très proche génétiquement (Ex : entre bovin/ovin et bovin/caprin).
Une solution contre les réactions croisées entre espèces peut être la cross-adsorption, qui est une déplétion en certaines IgG capables de réagir contre d’autres espèces très proches.
La source du bruit de fond peut également être du :
        - A la présence d'immunoglobulines dans le tissu étudié : on l'élimine en utilisant des anticorps secondaires purifiés par affinité et cross-adsorbés contre l'espèce du tissu étudié ou multi-cross-adsorbés contre plusieurs espèces proches.
        - Aux anticorps primaires : dans le cas de multiplexage utilisant des anticorps secondaires conjugués à différents fluorophores, il est recommandé d’utiliser ces secondaires cross-adsorbés contre toutes les espèces source des anticorps primaires.
Il faut savoir que seulement 2,5% des IgG total du sérum d’un animal sont spécifiques de l’antigène utilisé pour l’immuniser. On comprend aisément que la concentration d’un anticorps seul ne veut rien dire. C’est pourquoi, avant de transposer un protocole,  il faut savoir si les anticorps utilisés ont subi le même type de purification.

IHC : cas du « Mouse-on-mouse »

Si vous travaillez sur des tissus de souris, avec des anticorps primaires produits chez la souris vous pouvez obtenir un bruit de fond « souris sur souris » (mouse-on–mouse). Les secondaires utilisés dans ce cas seront des anti-souris qui reconnaitront le primaire mais aussi des IgG naturellement présents dans le tissu étudié ou les récepteurs de surface des cellules reconnaitront la partie Fc de l’anticorps secondaire.
Le multiplexage complique le choix des anticorps à utiliser, en raison du bruit de fond. Privilégier si possible  des primaires faits dans une autre espèce comme le lapin, des secondaires  IgG F(ab) ou F(ab’)2, ou des primaires directement marqués (détection directe à utiliser uniquement si la protéine cible est fortement exprimée). Malheureusement le multiplexage implique fréquemment d’utiliser des primaires de sources différentes; nous verrons plus loin que la fluorescence par les haptènes ou les tyramides permet d’y remédier.

Conjugaison de l’anticorps

Le type de conjugaison utilisé dépend de l’application et du niveau d’amplification souhaité. Elle peut être une enzyme (HRP, AP), une haptène (biotine, digoxygénine) ou un fluorophore (FITC, PE, Alexa Fluor™, CF™ Dyes…). On ne pourra pas faire correspondre un type de secondaire avec une application; il dépend aussi de la méthode de marquage choisie comme en IHC : indirecte HRP ou AP, méthodes ABC, LSAB ou PAP, HRP polymère, amplification avec des tyramides en fluorescence pour l’IHC multiplexe.
QUELLES SONT LES CARACTÉRISTIQUES DE L’ANTICORPS SECONDAIRE À CONSIDÉRER SELON L’APPLICATION ?
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Western Blot

On utilise en général des anticorps secondaires IgG (H+L) couplés HRP pour la révélation des WB en chimioluminescence avec un réactif de détection de type ECL.

Pour une révélation de WB en fluorescence, on utilise généralement des secondaires permettant de faire une révélation en multiplexe classiquement avec une longueur d’onde d’excitation proche de l’infra-rouge (680, 770, 790 et 800 nm). La lecture se fait sur LI-COR Odyssey® imaging systems  ou sur un imager avec caméra. On utilise dans ce cas des DyLight™, des Alexa Fluor®, ou des CF™ Dyes.
Liste des anticorps secondaires adaptés au WB révélé en chimio ou en fluo - Contacter notre support scientifique


Western Blot après IP

Quand on utilise un anticorps secondaire anti-chaîne légère ou chaine lourde des IgG ou un anti-IgG (H+L) pour détecter une protéine immuno-précipitée par un anticorps primaire, on détecte une bande à 25 kDa pour les chaines légères et une bande à 50 kDa pour les chaines lourdes de l’anticorps primaire. Ces bandes masquent couramment les bandes spécifiques de la protéine immuno-précipitée si elle a un poids moléculaire proche de 25 ou 50 kDa.

Pour éviter ce problème on peut donc utiliser un anticorps anti-chaîne légère si sa protéine d’intérêt fait 50 kDa ou un anti-chaîne lourde ou anti-Fc si sa protéine fait 25 kDa. Et si on attend des bandes à 25 kDa et 50 kDa on pourra utiliser un anticorps conformation spécifique qui ne reconnait que les IgG natives et non dénaturées. Il ne reconnaitra donc que l’anticorps primaire et pas l’anticorps utilisé pour immuno-précipiter la protéine d’intérêt.

Les anticorps anti-Fc ou chaîne lourde (α, δ, ε, γ et μ) réagissent uniquement avec la chaîne lourde.

Exemples d’utilisation de secondaires spécifiques du Western Blot après IP
Gels de wesyern blot montrant l'utilisant des secondaires après IP
Liste des secondaires adaptés au WB après IP (certains ne sont pas conjugués et nécessite l’utilisation d’un troisième anticorps) - Contacter notre service technique

Immunohistochimie (IHC)

Selon la technique de révélation choisie (voir schéma ci-dessous), on adapte le choix des secondaires à acheter seuls ou en kits plus ou moins complets (avec les substrats et si besoin avec les réactifs de blocage). Il existe des kits dédiés à une espèce (anti-souris, anti-lapin ou autre) faisant référence à l’espèce d’origine du primaire utilisé et des kits multi-espèces utilisable sur lapin et souris.
Pour faire le meilleur choix en termes de techniques de révélation, lire le TechOzyme mIHC
Techniques de révélation en IHC (colorimétrique)
Techniques classiques de détection en IHC (colorimétrie)


Liste des secondaires adaptés au marquage indirect sans amplification (AP ou HRP)

Liste des secondaires pour méthode de type ABC ou LSAB (biotinylés)

Liste des secondaires pour méthode PAP (secondaires non conjugués)

Liste des secondaires pour méthode « polymère » (polymères–HRP) en colorimétrie ou en fluorescence pour IHC multiplexe 

Immunofluorescence (IF)

Pour l’immunofluorescence, on aura le choix entre des secondaires conjugués à de nombreux fluorophores. Il faudra choisir en fonction des sources d’excitation et filtres présents sur son microscope.

Pour les marquages multiples, on choisit de préférence des anticorps secondaires cross-adsorbés pour réduire le bruit de fond au minimum (consulter le TechOzyme).

On pourra aussi utiliser des secondaires dirigés contre des sous classes d’IgG pour faciliter le multiplexage avec plusieurs primaires d’une même espèce comme la souris (voir les sous-classes plus haut et se référer au TechOzyme)


On aura le choix entre des secondaires conjugués à des fluorophores « classiques » ou ayant une stabilité supérieure (photo-bleaching) comme les Alexa Fluor®, DyLight® et  les CF™ Dyes particulièrement adaptés à la microscopie en fluorescence ou confocale.


Liste des secondaires conjugués à des fluorophores « classiques » (FITC, TRITC)

Liste des secondaires conjugués à des Alexa Fluor®

Liste des secondaires conjugués à des Dylight®

Liste des secondaires conjugués à des CF™ Dyes

On pourra également ajouter une étape d’amplification pour augmenter son signal en utilisant soit un secondaire biotinylé avec un anti-biotine conjugué à un fluorophore ou à la streptavidine conjuguée à un fluorophore. L’utilisation d’un secondaire conjugué HRP avec un substrat tyramide conjugué avec un fluorophore génére aussi un très bon niveau d’amplification (se référer au TechOzyme sur l’IHC multiplexe).


Liste des secondaires conjugués biotine

Liste des anti-biotines conjuguées

Liste des streptavidines conjuguées

Liste des conjugués tyramide disponibles


Microscopie en Super-résolution

Toute une gamme de secondaires conjugués à des CF ™ Dyes (CF™405M, CF™568, CF™647 et CF™680…) est disponible dans la gamme Biotium. Ce sont grâce à leur grande brillance, et leur photostabilité des secondaires optimaux pour la microscopie en super-résolution (3D-STORM,  3-D SIM, TIRF, STED…) et ils sont largement cités dans de nombreuses publications. Les CF™ Dyes validés en microscopie super résolution sont désormais notés avec ST : exemple CF™535ST.

Liste de secondaires conjugués avec des CF™ dyes validés en microscopie super résolution : contacter notre service technique

Cytométrie

En cytométrie, on choisit de préférence un marquage direct, c’est-à-dire un anticorps primaire conjugué à un fluorophore. Dans le cas où le primaire n’existe pas en version conjuguée, il est possible d’utiliser des secondaires conjugués à des fluorophores. On conseille plutôt des anticorps secondaires IgG F(ab)'2 purifiés par affinité pour éviter la fixation de la partie Fc au récepteur Fc des cellules vivantes, conjugués avec différents fluorophores permettant le mutiplexage. On choisit les fluorophores comme pour les anticorps primaires en construisant le panel (se référer au TechOzyme dédié à la construction de panel multi-couleurs).
QUESTIONS FRÉQUEMMENT POSÉES
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Quelles sont les causes les plus courantes de bruit de fond dus au secondaire ?

.   Un mauvais blocage des tissus ou des cellules

.   Une réactivité croisée du secondaire avec les immunoglobulines endogènes du tissu ou des cellules étudiés

.   Un mauvais lavage

.   Une réactivité du secondaire avec les immunoglobulines du diluant d’anticorps

.   Une dilution trop faible du secondaire

Quelles sont les causes les plus fréquentes de signaux faibles dus au secondaire ? (si l’antigène cible est présent et que l’anticorps primaire fonctionne)

.   L’antigène peut être présent mais en quantité insuffisante et une amplification peut être nécessaire surtout si on passe d‘un protocole d’IHC à un protocole d’IF
    sur tissus

.   Le primaire a été trop dilué

.   L’activité de l’enzyme est inhibée. L’azide de sodium n’est pas compatible avec HRP

.   Le secondaire choisi ne reconnait pas certains primaires

Quelles sont les précautions à prendre pour choisir son milieu de montage en IF et en IHC ?
Que ce soit en IF ou en IHC, le milieu de montage dépend du type d’anticorps secondaire utilisé :

.   Nature du fluorophore conjugué au secondaire,

.   Nature du couple enzyme - substrat utilisé
En IF, le montage est la dernière étape avant l’observation et peut inclure une étape de 

Les milieux de montage entre lame et lamelles, liquides ou solides, permettent la visualisation au microscope des préparations et la conservation des lames. Le vernis à ongles habituellement utilisé sert à sceller le bord de la lamelle dans le cas de milieu de montage liquide pour éviter la déshydratation. Pour l'IF, on utilise des milieux de montage ayant en plus la capacité de conserver la fluorescence (effet anti-photobleaching). Il faut aussi vérifier que le milieu de montage est adapté aux fluorophores utilisés. En effet, la présence de solvant dans certains milieux de montage les rend incompatibles avec les fluorophores.

En général, les milieux de montage qui restent liquides permettent une observation immédiate. Au contraire les milieux de montage qui se solidifient, nécessitent une étape supplémentaire de séchage–solidification.
Tous les milieux de montage existent avec ou sans intercalant, comme le DAPI pour faire un contre marquage simultané du noyau.


En IHC, après l’étape d’immuno-marquage, les milieux de montage sont utilisés pour faire adhérer la lamelle à la coupe de tissu ou aux cellules étalées. Il est important car il protège l’échantillon et le marquage. Il joue aussi un rôle en améliorant la netteté et le contraste de l’image pendant l’observation au microscope.
Il y a deux catégories de milieux de montage : organique et aqueux (ou respectivement hydrophobe et hydrophile).

.   Un milieu de montage organique - dit permanent - doit être utilisé uniquement pour des marquages enzymatiques donnant un précipité insoluble dans les
    solvants organiques (comme le DAB).

.   Les milieux de montage aqueux sont utilisés pour tous les chromogènes.

Nous proposons ces 2 types de milieu de montage :

Que faut-il savoir sur les conditions de stockage des anticorps secondaires ?

De manière générale, voici quelques règles de conservations s’appliquant aux secondaires ou aux primaires conjugués.
Les anticorps sont plus stables sous forme concentrée (>1 mg/ml). Les protéines en général n’aiment pas les cycles de congélation /décongélation successives, il est donc recommandé d’aliquoter.

A plus faible concentration (<0.1 ml/ml), il est nécessaire de rajouter de petites quantité de détergent ou de protéines stabilisatrices ou « carrier » (0,1%  Tween 20 ou 1% de BSA ou parfois gélatine) pour stabiliser. Il est donc fortement déconseillé de diluer soi-même son anticorps pour le conserver dilué et prêt à l’emploi car aucun stabilisant n’est présent en quantité adéquate. Et la dilution peut  facilement se contaminer en l’absence de conservateur. Parfois le tampon est complété par des conservateurs type azide de sodium ou Kathon CG. Aucun conservateur n’est nécessaire si l’anticorps est conservé à -20°C.
A noter que l’activité de l’enzyme HRP est inhibée par l’azide de sodium et que les anticorps conjugué à l’HRP sont soit formulés avec du Kathon CG (qui n’inhibe pas l’activité enzymatique) ou sans conservateur s’ils sont stockés à -20°C.
Les anticorps sont vendus sous forme lyophilisée ou en solution concentrée ou diluée. On conseille toujours de suivre les recommandations du fournisseur en se référant à la fiche technique fournie.

Les anticorps lyophilisés contiennent déjà des stabilisants et parfois les conservateurs nécessaires. Une fois réhydratés, ils se conservent à +4°C mais peuvent être congelés à -20°C pour un stockage plus long si on rajoute du glycérol (50% final). A noter cependant, qu’il faut être vigilant sur la qualité de l’eau et/ou du glycérol utilisé car ils peuvent être facilement contaminés. On utilise donc des solutions stériles.
A noter que les anticorps conjugués à des fluorophores supportent très mal la congélation.
Les anticorps conjugués à des enzymes ou à des fluorophores peuvent se conserver à +4°C ou à -20°C (si le fabriquant le valide) selon la formulation. Un anticorps dilué en tampon phosphate sans glycérol doit être conservé à +4°C. S’il est formulé en 50% glycérol (cryoprotectant), il peut être congelé sans problème en évitant bien sûr de multiplier les cycles décongélation/décongélation. L’intérêt du glycérol est qu’il abaisse le point de congélation  de la solution et que l’anticorps reste liquide (non congelé à -20°C).

Pour les anticorps déjà disponibles en 50% glycérol, il est déconseillé de les aliquoter. En effet en raison de la forte viscosité de la solution si on aliquote sans préalablement bien mélanger on risque de récupérer des tubes sans ou avec très peu d’anticorps.
Que faut-il savoir sur la compatibilité d’un anticorps secondaires et de l’ECL ?

En Western Blot, on utilise un réactif de détection de type ECL avec un secondaire conjugué à l’enzyme HRP. Il existe de nombreux types de réactifs ECL disponibles ayant des sensibilités très variées et permettant de détecter des protéines de quelques dizaines de femtogrammes à quelques dizaines de picogrammes (seuil de détection).

De ce fait, il faut adapter la concentration finale de son secondaire-HRP en fonction du réactif ECL choisi. En effet plus le réactif de révélation est sensible, plus il faudra diluer son secondaire d’une dilution 5 000 à 500 000 environ sur une base d’un secondaire concentré à 1 mg/ml. Pensez, quand vous changez l’ECL pour augmenter la sensibilité, à ajuster la concentration de votre anticorps secondaire sinon vous générerez du bruit de fond et à l’inverse vous risquez de perdre votre signal. Pensez aussi quand vous changez d’anticorps secondaire, à ajuster la concentration du secondaire « en concentration » et non de manière automatique « en dilution » car tous les secondaires commerciaux ne sont pas formulés à 1mg/ml.
Schéma pour la dilution de l'anticorps secondaire -HRP