TECHOZYME
BIEN UTILISER LES FLUOROPHORES DITS « TANDEM » EN CYTOMÉTRIE EN FLUX
Comment utiliser correctement les fluorophores dits "tandem" en cytométrie en flux
L’analyse multicouleur en cytométrie en flux est un outil précieux dans l’identification de sous-populations cellulaires. Les tests d’immunophénotypage incorporent désormais l’analyse simultanée de plusieurs marqueurs et sont facilités par l’utilisation de fluorophores dits “tandems”, en complément des fluorophores classiques. Cependant, inclure les tandems dans les panels de cytométrie signifie prendre en considération leurs limitations techniques. Leur instabilité notamment peut modifier leurs propriétés spectrales et générer des données incorrectes.

Dans ce TechOzyme, après un descriptif des tandems, nous aborderons leurs différentes limitations et proposerons des conseils pour les utiliser avec succès dans les panels de cytométrie en flux. La nouvelle génération de tandem sera aussi présentée.
QU'EST-CE QU'UN TANDEM ? AVANTAGES DE SON UTILISATION
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Un tandem est composé de 2 molécules fluorescentes attachées de manière covalente, l’une servant de donneur et l’autre d’accepteur. Selon le processus de FRET (Förster ou Fluorescence Resonance Energy Transfer), quand la molécule donneur est excitée, elle transfère son énergie à la molécule accepteur qui émet de la fluorescence. Le tandem se comporte alors comme un fluorophore unique avec les propriétés d’excitation du donneur et les propriétés d’émission de l’accepteur. A la différence des fluorophores classiques, la longueur d’onde d’émission des tandems est généralement beaucoup plus grande que la longueur d’onde d’excitation. On dit alors que les tandems ont un déplacement de Stokes élevé (c’est à dire une grande distance entre les maxima d’absorption et d’émission). Cette particularité des tandems a pour avantage de faciliter la réalisation des marquages multiples en conjonction avec des fluorophores ayant des déplacements de Stokes plus faibles (comme le FITC par exemple).

Historiquement, les 1ers tandems ont été développés à la fin des années 1980 et étaient basés sur la phycoérythrine (ou PE) comme molécule donneur. Citons par exemple : PE/Cy5 et PE/Cy7 avec comme molécule accepteur Cy5 et Cy7, respectivement. Dans les années 1990, de nouveaux tandems ont été générés avec l'APC (AlloPhycoCyanin) ou le PerCP (Peridinin Chlorophyll Protein) en molécule donneur. Parmi ces tandems, on retrouve l’APC/Cy7 et le PerCP/Cy5.5. La majorité des tandems commercialisés durant ces années étaient adaptés aux lasers 488 nm (laser bleu) et 640 nm (laser rouge) qui étaient présents sur la plupart des cytomètres de l’époque.
LES LIMITES DES TANDEMS ET LES CONSEILS POUR PRÉSERVER LEURS PERFORMANCES
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Même si les tandems sont utiles en cytométrie en flux pour les  analyses multicible, ils ne sont pas sans limitation. Relativement instables, ils nécessitent une attention et des précautions particulières lors de leur manipulation lorsqu’ils sont inclus dans les panels multicouleur.

L’efficacité de FRET des tandems n’est jamais de 100 %, ce qui signifie qu’il existe toujours une émission résiduelle de la molécule donneur. L’intensité de cette émission dépend de la qualité du tandem. Pour l’évaluer et la prendre en compte dans les analyses, il est nécessaire d’utiliser des isotypes contrôle et faire des simple-marquages pour régler correctement les compensations. 

L’efficacité de FRET et donc les caractéristiques spectrales peuvent aussi varier entre différents lots d’un même tandem. Par conséquent, il est généralement recommandé de revoir les compensations pour chaque nouveau lot et d’utiliser un même lot pour l’intégralité d’une étude.
Des règles de fabrication sont à vérifier pour les anticorps conjugués et en particulier pour les anticorps couplés à des tandems. Parmi ces règles :

.   Le ratio donneur:accepteur
.   Le ratio F/P (Fluorescence to Protein - Ratio de conjugaison du tandem)
.   Une émission minimale à partir du donneur
.   Chaque lot est contrôlé pour ses performances pré- et post-conditionnement dans les tubes, garantissant la reproductibilité des résultats entre lots.

Le problème le plus important et le plus documenté dans la littérature est l’extrême sensibilité et la dégradation ou découplage des tandems. Lors de ce processus (aux origines multiples, comme nous le verrons plus loin), les molécules donneur et accepteur du tandem liées de manière covalente, ne se disloquent pas en solution ; mais, on observe une augmentation d’émission du donneur et une perte d’émission de la part de l’accepteur. Ceci est particulièrement problématique si des fluorophores excités par le même laser sont utilisés. Par exemple, si le PE et le PE/Cy7 sont utilisés dans un même panel et que le PE/Cy7 commence à se dégrader, la lumière qu’il émet sera détectée dans le canal du PE générant des données erronées.
Quelles sont les causes principales du découplage des tandems ?
Exposés à la lumière, les tandems se dégradent via un phénomène appelé « PhotoBleaching » (photo dégradation), qui altère le donneur et l’accepteur de manière irréversible. Leurs propriétés spectrales sont alors modifiées. Il est donc recommandé de stocker les tandems dans des tubes opaques pour augmenter leur longévité. De plus, il est conseillé de protéger les échantillons (cellules) de la lumière lors de leur marquage.

La congélation des tandems peut conduire à la dénaturation de la protéine donneur. Ces fluorophores doivent donc être conservés à +4°C.

Certains tandems, comme ceux dérivés de l’APC, se découplent aussi via l’activité métabolique propre aux cellules. L’article « Flow cytometry APC-tandem dyes are degraded through a cell-dependent mechanism  »  montre comment les cellules elles-mêmes jouent un rôle dans la dégradation spécifique des tandems  
Par conséquent, réaliser le marquage des échantillons à +4°C permet de ralentir le métabolisme cellulaire et préserve la stabilité des tandems.

Les radicaux libres peuvent également endommager les tandems.

Les tandems, notamment ceux dérivés du PE et de l’APC, sont très sensibles à certaines méthodes de fixation, comme celle au paraformaldéhyde (PFA). Une exposition prolongée au PFA peut altérer la conformation des protéines et entrainer une perte de réactivité des anticorps pour leur cible. La fixation doit donc être réalisée sur une durée très courte (moins de 30 minutes) et être suivie d’un lavage et d’une remise en suspension dans du tampon de marquage cellulaire.
GUIDE DES BONNES PRATIQUES D’UTILISATION DES ANTICORPS COUPLÉS AUX TANDEMS
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. Les tandems doivent être en permanence protégés de la lumière puisqu’ils sont sensibles au « photobleaching ». Les échantillons marqués doivent également   être éloignés de la lumière et il est recommandé de faire l’acquisition et l’analyse de ces échantillons le plus rapidement possible.

. Les tandems ne doivent jamais être congelés car la congélation peut dénaturer la molécule donneur et générer un marquage réduit, voire absent. Il est déconseillé de les exposer à des écarts de température importants.

. La brillance des tandems peut être altérée suite à leur fixation ou perméabilisation. Si ces étapes sont nécessaires, elles doivent être les plus douces possible et leur durée la plus courte possible. Les échantillons doivent ensuite être analysés rapidement.

. Les performances des tandems peuvent différer :
.   selon les lots : chaque lot doit donc être ré-optimisé / ré-évalué.
.   selon les fournisseurs : pour des expériences répétées, il est préférable d’utiliser les tandems d’un même fournisseur.

. Lors de l’utilisation de tandems dans un panel multicouleur, il est important d’établir des contrôles appropriés :  isotypes contrôles, cellules non marquées, contrôle simple marquage et FMO (Fluorescence Minus One) pour établir les « gates » correctement.

. Lors du design d’un panel de cytométrie incluant des tandems, il est conseillé de regarder en amont comment le profil de découplage du tandem peut interférer avec la détection des autres fluorophores. Si possible, il faut éviter les combinaisons d’anticorps où le profil de découplage du tandem est proche du profil d’émission du fluorochrome donneur. Par exemple : si le tandem PE/Cy7 est utilisé avec le PE, le découplage du PE/Cy7 génère une émission parasite dans le canal du PE.

. Il est préférable d’utiliser le même anticorps tandem pour les tubes de compensation et le marquage des échantillons expérimentaux, en raison des variations d’efficacité de FRET entre les lots d’anticorps et au cours du temps. Faute de quoi, les compensations ne seront pas calculées correctement et les données ne seront pas interprétables. Autre option : utiliser des billes de compensation pour régler les compensations.

. Il est conseillé de contrôler régulièrement les performances des tubes de tandems ouverts, en particulier s’ils sont stockés et utilisés plusieurs fois sur une longue période.
LE SAVIEZ-VOUS ?
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Que signifie le ratio F/P ?
Le ratio F/P (Fluorescence to Protein) indique le nombre moyen de molécules de fluorophore conjugué à chaque anticorps. Cette valeur peut varier selon les fabricants et même au sein de différents lots d’un même fabricant. Ainsi, quand on utilise un isotype contrôle, il est important de vérifier que celui-ci a un ratio F/P identique à celui de l’anticorps primaire.

Quel est le ratio F/P de mon anticorps conjugué ?
Tous les anticorps couplés PE, APC ou à leurs tandems ont un ratio F/P de 1/1. Les autres formats, FITC ou Alexa ont des ratios F/P variables, généralement dans une échelle de 3 à 7.
QUESTIONS FRÉQUEMMENT POSÉES
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Est-il possible de congeler mes anticorps de cytométrie en flux ?
Il est déconseillé de congeler les anticorps car cela risque de les dénaturer ou entrainer le découplage du fluorochrome tandem de l’anticorps durant les étapes de congélation/décongélation. De plus, les anticorps peuvent former des aggrégats et se lier de manière non spécifique aux cellules. Les anticorps doivent être conservés à +4°C et à l’abri de la lumière.

Est-il possible d’utiliser dans un même panel le PE et le PE/Dazzle™ 594 ?
Oui. Mais, quelques compensations seront néanmoins nécessaires. Nous conseillons donc d’associer ces fluorochromes à des marqueurs non co-exprimés sur la même cellule.