TECHOZYME
OPTIMISATIONS POUR RÉUSSIR VOS TRANSFECTIONS D'ADN
Transfection d'ADN - Tout savoir pour les réussir
L’expression d’un gène, d’un promoteur ou d’une protéine, à partir d’un ADN plasmidique transfecté dans des cellules en culture est un puissant outil pour étudier une régulation d’activité promotrice, la fonction des protéines ou contrôler des événements intracellulaires. Pour obtenir des résultats optimaux, reproductibles et fiables, les conditions de transfection nécessitent d’être optimisées pour chaque type cellulaire. Les optimisations ne consistent pas seulement à faire en sorte que les cellules capturent le maximum d’ADN et expriment ensuite le maximum de protéines. Il est en effet important de trouver le meilleur équilibre entre l’expression maximale d’un gène ou d’une protéine et un impact minimal sur la viabilité cellulaire.
Dans ce TechOzyme, nous aborderons les différents paramètres influençant l’efficacité de la transfection et les optimisations possibles pour une transfection réussie.
LES FACTEURS INFLUENÇANT L’ÉFFICACITÉ DE LA TRANSFECTION 
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Les conditions de la transfection doivent être optimisées en fonction :
•   Des cellules
•   De la taille du plasmide
•   Du nombre de plasmides transfectés
•   Du profil d’expression du gène d’intérêt
•   Du format de plaque de culture
•   Et, du réactif de transfection
Pour optimiser les résultats, il est nécessaire de redéfinir les conditions pour chaque nouvelle lignée cellulaire, puisque chaque type cellulaire peut répondre différemment à un même agent de transfection.

La santé des cellules :
Les cellules doivent être activement en division avant l’étape de transfection, passées régulièrement dans du milieu de croissance frais, supplémenté selon les besoins du type cellulaire (sérum, facteurs de croissance ...). Le nombre de passages des cellules doit aussi être pris en considération :
•   Dans le cas de cellules fraichement décongelées, il est recommandé d’attendre 2 passages avant la transfection pour que les cellules aient eu le temps de récupérer
•   Il est déconseillé d’utiliser des cellules ayant subi plus de 20 passages, car le risque est une différentiation non voulue caractérisée par des changements morphologiques, des vitesses de croissance modifiées et probablement une production protéique et une plus faible réponse aux stimuli.
•   De manière générale, les cellules activement en division sont plus réceptives à l’introduction d’ADN étranger que des cellules quiescentes. En effet, au moment de mitose, la disparition de l'enveloppe nucléaire permet à l'ADN de pénétrer dans le noyau.

La densité cellulaire :
•   Une densité cellulaire trop élevée peut provoquer une inhibition de contact, conduisant à une mauvaise absorption d'acides nucléiques et / ou une diminution de l'expression du gène transfecté.
•   Une densité trop faible de cellules peut entraîner une mauvaise croissance, sans contact entre les cellules. Dans ce cas, l'augmentation du nombre de cellules en culture améliore l'efficacité de la transfection.

Idéalement la confluence des cellules doit être comprise entre 40 et 80% et leur viabilité supérieure à 95% au moment de la transfection.
La qualité de la préparation d’ADN à transfecter :
Les ADN plasmidiques utilisés doivent être hautement purs :
•   Ratio Absorbance260 / Absorbance280 = 1.7 – 1.9
•   Un faible taux d’endotoxines est nécessaire pour éviter les réponses cellulaires fortuites, comme de la cytotoxicité ou la production de cytokines pro-inflammatoires Pendant la préparation de l’ADN plasmidique, ces endotoxines (ou lipopolysaccharides (LPS), composants de la membrane cellulaire des bactéries Gram-négatives (E.coli) sont libérées durant l’étape de lyse des bactéries et souvent co-purifiées avec l’ADN plasmidique. La présence d’endotoxines dans l’ADN plasmidique peut réduire drastiquement les efficacités de transfection, en particulier pour les cellules primaires et les lignées cellulaires plus sensibles. Dans le cas de cellules sensibles aux endotoxines (cellules primaires, cellules en suspension et cellules hématopoïétiques) ou pour augmenter l’efficacité de la transfection et limiter la cytotoxicité, il est recommandé d’utiliser des kits commerciaux pour obtenir de l’ADN de haute qualité, exempt d’ARN ou de protéine. Il est cependant conseillé de toujours vérifier l’absence de contamination ARN par électrophorèse sur gel d’agarose et coloration au bromure d’éthidium. Les ADN préparés doivent être dilués dans de l’eau stérile ou du tampon TE, puis aliquotés et conservés à -20°C pour éviter les cycles de congélation/décongélation.

Le respect des ratios quantité d’ADN / quantité de transfectant / nombre de cellules :
En fonction du format de plaques dans lequel la transfection est réalisée, 3 paramètres intimement liés sont à respecter :
•   Utiliser le nombre adéquat de cellules pour que le degré de confluence soit respecté
•   Adapter la quantité d’ADN au nombre de cellules utilisées
•   Définir la quantité de transfectant appropriée

Le mode d’application du complexe ADN/transfectant sur les cellules :
Il y a deux possibilités d’ajouter le complexe de transfection aux cellules :
•   Soit le mélange ADN/transfectant est distribué goutte à goutte dans le milieu
•   Ou bien, il est pré-dilué dans le milieu avant de le déposer sur les cellules
La 1ère option est plus pratique et la seconde évite que des doses toxiques soient appliquées localement aux cellules.

La présence de contaminants :
Il est conseillé de vérifier régulièrement l’absence de contaminant comme des levures, des bactéries et des mycoplasmes. Ces derniers sont invisibles en microscopie classique en raison de leur taille (entre 0,2 µm et 0,8 µm) et leur présence a des conséquences sur la croissance cellulaire et entraine des résultats non reproductibles et non interprétables. Il est donc primordial de vérifier toutes contaminations par des mycoplasmes. Plusieurs méthodes existent : PCR, test sur gel d’agarose, coloration de Hoechst, test enzymatique (MycoAlert™ PLUS Mycoplasma Detection Kit). Nous conseillons cette dernière plus rapide et plus sensible.

Le sérum :
Le protocole envoyé avec le réactif de transfection doit être suivi. La présence de sérum et d’antibiotiques peut inhiber certains agents de transfection. D’autres fonctionnent parfaitement en leur présence réduisant les risques de toxicité et le nombre d’étapes du protocole.
Certains sérums pouvant inhiber drastiquement l’efficacité de transfection, chaque nouveau lot de sérum doit être vérifié.

L’incubateur CO2 :
Les cellules sont incubées à 37°C dans un incubateur CO2 avec une humidité relative de 100 %. Le CO2 est nécessaire pour le contrôle du pH, essentiel au maintien de la physiologie cellulaire. Certains milieux requièrent une concentration en CO2 de 5 %, tandis que pour d’autres milieux, 10 % de CO2 sont nécessaires. De même, la présence d’une contamination chimique, bactérienne ou fongique dans l’incubateur affecte la physiologie cellulaire.
Le respect de ces conditions d’incubation est essentiel pour assurer une reproductibilité des résultats entre différentes transfections.
RECOMMANDATIONS POUR AUGMENTER L'ÉFFICACITÉ DE LA TRANSFECTION
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Optimiser la quantité d’ADN par rapport au nombre de cellules utilisées :
Pour une transfection plus efficace, il est possible d’augmenter la quantité d’ADN transfectée. Attention, cependant, trop d’ADN transfecté peut réduire l’expression protéique et modifier négativement la santé des cellules. On parle alors d’effet cytotoxique sur la cellule. Il faut trouver le meilleur rapport quantité de cellules/ADN. Ces ratios diffèrent en fonction du type de transfectant et du type cellulaire transfecté. Les nouveaux transfectants comme le jetPRIME™ ont été développés pour travailler à de faibles quantités d'ADN.

Optimiser la quantité de transfectant : tester différents ratios quantité d’ADN / quantité de transfectant :
Il est possible de faire varier le ratio quantité d’ADN / quantité de transfectant en fonction du type cellulaire. Il est cependant recommandé de ne pas trop augmenter cette quantité car cela peut s’avérer toxique. Une quantité insuffisante de complexe ADN / transfectant peut entrainer une expression sous-optimale.

Respecter le temps d’incubation ADN et transfectant :
Il est recommandé de suivre le protocole fourni avec l'agent de transfection. Ce temps varie généralement entre 5 et 30 minutes et dépend de la nature des agents de transfection.

Optimiser la quantité de complexe ADN / transfectant appliquée aux cellules :
•   Si la quantité de complexe ajoutée aux cellules est trop faible : le niveau d’expression protéique est faible.
•   Si trop de complexe est utilisé sur les cellules : l’expression peut diminuer en raison d’effets cytotoxiques par exemple.
La dose optimale de complexe ajoutée aux cellules doit être déterminée expérimentalement pour chaque lignée cellulaire.

Passer à un protocole dit « reverse » de transfection :
Dans la méthode traditionnelle de transfection, les cellules sont d’abord incubées dans les plaques, puis le complexe ADN / transfectant est ajouté sur les cellules. Dans le cas du protocole « reverse », on dépose les cellules sur les puits ou plaques contenant déjà les complexes de transfection ce qui peut augmenter l’efficacité de transfection. Un autre avantage de cette méthode dite « reverse » est le gain de temps car l’ensemencement et la transfection des cellules se fait le même jour. Attention toutefois, tous les réactifs de transfection ne sont pas compatibles avec ce protocole « reverse ».

Minimiser la cytotoxicité :
Utiliser des quantités moindres d’ADN et de transfectant permet de réduire la cytotoxicité. Pour maintenir la viabilité cellulaire, il est possible de remplacer le milieu dès 4 heures après la transfection. Il est également nécessaire de vérifier que le gène transfecté n’affecte pas la viabilité cellulaire. Pour cela, la transfection est analysée plus tôt, par exemple après 24 heures au lieu de 48 heures.

Analyser la transfection à différents temps :
Typiquement, l’analyse de l’expression du gène reporter ou de son gène d’intérêt est réalisée 24 à 48 heures après le début de la transfection. Mais, le niveau d’expression des protéines au cours du temps post-transfection est variable selon les protéines et selon la force du promoteur sous lequel le gène est sous-cloné dans le vecteur plasmidique. Pour cette raison, il est recommandé de faire un suivi de 24 heures à 96 heures post-transfection.

Utiliser des contrôles appropriés :
Des gènes rapporteurs sont utilisés pour configurer et optimiser les conditions entre différentes expériences de transfection en comparant les niveaux d’expression de leurs produits. De nombreux systèmes sont disponibles commercialement. Luciférase Renilla, GFP (Green Fluorescent Protein), béta-galactosidase sont les plus couramment utilisés car leur expression est facilement contrôlée. Les gènes rapporteurs sont utilisés seuls ou fusionnés au gène d’intérêt pour déterminer le niveau d’expression protéique, le nombre de cellules positives ou la localisation de la protéine étudiée.

Utiliser du milieu frais :
Les milieux commerciaux couramment utilisés sont le RPMI1640 et le DMEM. Les constituants de ces milieux sont des nutriments (acides aminés, glucose), des vitamines, des sels inorganiques. Certains de ces composants sont instables, c’est pourquoi il est recommandé d’utiliser du milieu frais.

Changer le milieu après la transfection :
Certains réactifs de transfection nécessitent que le milieu soit changé quelques heures après la période de capture du complexe ADN/transfectant. Cette étape est notamment cruciale si la transfection doit être réalisée en l’absence de sérum. Avec des transfectants non toxiques, qui fonctionnent en présence de sérum, cette étape de lavage peut être éliminée.
OUTILS ACCESSIBLES EN LIGNE
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Vous recherchez quel transfectant et quel protocole utiliser avec votre lignée d’intérêt ?
Les conditions mentionnées doivent être considérées comme des directives générales, puisque les conditions de transfection sont à optimiser pour chaque application spécifique.

Vous recherchez une publication relative à la transfection d’un type cellulaire donné avec une biomolécule particulière (ADN, siRNA, oligo, miRNA, …) ?
QUESTIONS FRÉQUEMMENT POSÉES
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Quels sont les facteurs qui déterminent le degré de transfectabilité d’une cellule ?
La capacité d’une cellule à faire de l’endocytose et à proliférer est le 1er critère influençant le niveau de transfectabilité d’une cellule. Ainsi, les cellules à faible prolifération (cellules primaires et nerveuses) ou à faible activité d’endocytose (lymphocytes, cellules Jurkat) sont difficiles à transfecter. Un autre facteur clé est l’activité nucléase cytosolique qui est spécifique à chaque type cellulaire. Si elle est très élevée, cela entraine la dissociation de l’ADN du complexe ADN-transfectant, puis la dégradation très rapide et totale de cet ADN.

Peut-on prédire de la transfectabilité d’un type cellulaire donné ?
Les interactions entre les caractéristiques spécifiques de chaque type cellulaire et tous les réactifs de transfection sont si complexes qu’il est impossible de prédire l’efficacité de transfection. Pour la majorité des transfectants utilisé en routine dans les laboratoires, il est indispensable de mener des études d’optimisation pour identifier le potentiel de transfectabilité.

Comment mesurer l’efficacité de transfection et déterminer précisément les cellules transfectées ?
Le niveau d’expression protéique des cellules transfectées (ou l’efficacité de transfection) peut être mesuré par PCR en temps réel, par Western blot ou encore par microscopie. Identifier les cellules positives au sein d’une population de cellules transfectées est possible par microscopie et cytométrie en flux. Finalement, pour confirmer la localisation d’une protéine d’intérêt, la microscopie est utilisée.

Que faire si le produit de l’ADN transfecté est toxique pour la cellule ?
L’expression d’un gène toxique entrainera la mort des cellules. Dans ce cas, il est recommandé d’utiliser un vecteur plasmidique contenant un promoteur faible ou inductible.

Quelle méthode de transfection utiliser pour les cellules difficiles ou les cellules en suspension ?
Certains types cellulaires, particulièrement ceux se divisant lentement tels que les neurones, les cellules primaires, ou les cellules en suspension (lymphocytes B et T) sont difficiles à transfecter avec de l’ADN. Dans ce cas, il sera judicieux d’opter pour une autre méthode pour réaliser le transfert d’acides nucléiques :
•   Utiliser des vecteurs viraux :
•   AAV
•   rétro-ou lenti
•   Electroporer l’ADN
•   Transfecter une autre molécule, par exemple l’ARN messager : la transfection d'ARNm est aussi simple que la transfection d'ADN, avec l'avantage que l'ARNm n'a pas besoin d'atteindre le noyau et ne nécessite pas que la cellule se divise pour générer une expression génique optimale.
LE SAVIEZ-VOUS ?
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Les facteurs influençant l’intégrité de l’ADN transfecté :
L’intégrité et la future fonctionnalité de l’ADN transfecté peuvent être affectées par les facteurs suivants :
•   Les coupures dans l’ADN double-brin
•   La dégradation par les nucléases
•   Le stress physique durant le stockage
•   La manipulation de l’ADN transfecté.

La configuration de la molécule d’ADN peut influencer l’efficacité de transfection :
•   La transfection transitoire est plus efficace avec de l’ADN plasmidique super-enroulé
•   Pour les transfections stables, les ADN linéaires sont privilégiés permettant une intégration optimale dans le génome des cellules hôtes.