TECHOZYME
DOSAGE D’ANALYTES : ELISA EN SANDWICH
LES CONSEILS POUR BIEN CHOISIR SON KIT ELISA
L’ELISA ou « Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay » est une technique immuno-enzymatique sur support solide pour détecter et quantifier la présence d'un analyte dans un échantillon. L’analyte peut être une cytokine soluble, une chimiokine, un facteur de croissance ou même une hormone présente à de très faibles concentrations (du nanogramme au picogramme/ml) dans du plasma, du sérum, des surnageants de culture cellulaire ou dans d’autres fluides biologiques. L’ELISA repose sur le principe de fixation spécifique d’un anticorps à un antigène. C’est une technique hautement sensible et spécifique, fiable et reproductible.

Dans ce TechOzyme, après une brève présentation de l’ELISA dit en sandwich et de ses avantages, nous décrivons les différents formats d’ELISA en sandwich et les critères pour choisir de façon appropriée le format de son kit. Nous expliquons également la signification des données techniques fournies avec les kits ELISA, données liées à la validation des kits. Nous terminons par une présentation du dosage en multiplex pour détecter simultanément plusieurs analytes.
ELISA EN SANDWICH ET SES AVANTAGES
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La technique d'ELISA a été conceptualisée et développée par 2 scientifiques suédois, Peter Perlmann et Eva Engvall à l'Université de Stockholm en 1971.

Le principe de cette technique immuno-enzymatique de détection est simple. Il s’agit de visualiser une réaction antigène-anticorps grâce à une réaction enzymatique colorimétrique. L’enzyme, préalablement fixée à l’anticorps, catalyse une réaction chimique qui transforme son substrat en composé coloré.

L'utilisation d'anticorps monoclonaux rend la détection plus  sensible et spécifique et il est possible de quantifier les analytes dosés grâce à la réalisation d'une gamme étalon (en concentration) en parallèle.

L’ELISA en sandwich consiste à isoler une protéine, que l’on cherche à doser, entre deux anticorps dirigés contre elle mais reconnaissant des épitopes différents.

En détail :
.   Les puits d’une plaque sont coatés avec un anticorps de capture de quantité connue.
.   L'échantillon contenant l’antigène à doser est ajouté et tout antigène présent se lie à l'anticorps de capture.
.   La plaque est rincée pour éliminer tout antigène non lié.
.   Un anticorps de détection (anticorps primaire) est ajouté et se lie à l'antigène.

Si l’anticorps de détection est directement couplé à une enzyme (biotine), on parle d’ELISA Sandwich direct.
Si l’anticorps de détection n’est pas conjugué, on utilise un second anticorps de détection (anticorps secondaire couplé biotine) et on parle alors d’ELISA Sandwich indirect (cf. schéma ci-dessous).
On incube ensuite avec de la streptavidine-HRP. Puis, le substrat de l’HRP (Horse Radish Perxoxydase) est ajouté et converti en un produit détectable en lecture de DO.
Schéma d'ELISA en sandwich
Les anticorps de capture et de détection doivent être correctement choisis pour éviter toute cross-réactivité et compétition au niveau des sites de liaison de l’antigène.
Les avantages des kits ELISA en Sandwich :
Une haute spécificité car 2 anticorps sont utilisés pour capturer et détecter spécifiquement l’antigène (ou analyte) à doser
Une haute flexibilité et sensibilité car des méthodes de détection directe et indirecte peuvent être utilisées
Une adaptabilité de ces kits y compris avec des échantillons complexes, puisque l’antigène ne nécessite aucune purification avant son dosage
LES DIFFÉRENTS TYPES DE KIT ELISA EN SANDWICH
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Il existe 3 formats différents d’ELISA en fonction de leur composition. Du plus basique au plus complet :

Les kits dits standard contenant uniquement les anticorps de capture et de détection pré-titrés, l’avidine-HRP et une protéine recombinante pour réaliser la courbe étalon.

Les kits que l’on peut appeler intermédiaires qui contiennent tous les éléments des kits standards mais aussi des microplaques, des tampons (tampon de dilution, tampon pour coater les plaques) et le substrat TMB.

Les kits dits prêts à l’emploi composés de plaques directement pré-coatées avec l’anticorps de capture et l’ensemble des réactifs dont les tampons nécessaires à la réalisation du dosage ELISA.


Les tests ELISA génèrent 3 types de données :

Qualitatives : les tests ELISA peuvent être utilisés pour obtenir une réponse OUI/NON indiquant si un antigène particulier est présent ou pas dans un échantillon, en comparant avec un puits blanc ne contenant pas d’antigène (contrôle négatif)

Semi-quantitatives : il est possible de comparer les taux relatifs d’un antigène dans des échantillons, puisque l’intensité du signal est directement corrélée à la concentration de l’antigène

Quantitatives : les données sont comparées avec une courbe standard / étalon (réalisée avec des dilutions en série d’un antigène ou d’une protéine recombinante donnée) pour calculer précisément les concentrations de l’antigène étudié dans divers échantillons
LES CRITÉRES POUR CHOISIR SON KIT ELISA EN SANDWICH
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Il convient dans un 1er temps de choisir son kit ELISA en fonction de la cible à doser et de l’espèce étudiée, homme, souris, rat, voire des espèces moins courantes comme le chien, le porc, …

D’autres paramètres rentrent en compte comme le temps à allouer à la manipulation, le niveau de familiarisation avec la technologie ELISA et le budget disponible.

Les 3 formats présentés plus haut  répondent à ces paramètres.
En complément des différents critères précédemment mentionnés, les données de validation des kits ELISA fournies avec chaque kit peuvent aider l’expérimentateur dans son choix. Ces différentes spécificités techniques des kits ELISA sont détaillées dans la rubrique ci-dessous.
SIGNIFICATION DES DONNÉES TECHNIQUES FOURNIES AVEC LES KITS ELISA
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A. Courbe standard, Sensibilité et Gamme de détection

Généralement, les kits ELISA commerciaux sont fournis avec ces 3 données :

- Courbe standard : pour chaque lot de kit ELISA, des séries de dilutions sont réalisées à partir d’une protéine recombinante standard pour réaliser la courbe standard idéale. Celle-ci doit être linéaire pour être correcte.

- Sensibilité : elle indique la limite de détection et de quantification. Elle donne le niveau le plus bas de l’analyte qui peut être dosé et distinct du bruit de fond. Cette donnée fournie avec chaque kit ELISA est indispensable pour s’assurer que le kit convient bien à la détection de sa cible d’intérêt qui peut être en quantité très faible dans ses échantillons.

-  Gamme de détection ou Gamme dynamique : il représente les concentrations maximale et minimale de l’analyte ciblé que le test peut quantifier précisément. Cette gamme dynamique s’étend du plus bas point au point le plus élevé de la courbe standard. Elle est comprise entre quelques pg/ml et quelques ng/ml. Pour les cibles qui sont abondantes dans un échantillon biologique, celui-ci devra être dilué au préalable pour que le signal brut de l’échantillon entre dans la gamme de détection du test.

Exemple avec le kit Human IL-10 avec une sensibilité < 4.688 pg/ml et une gamme dynamique comprise entre 7.813 et 500 pg/ml
B. Précision ou % CV

La précision de l’ELISA est définie sur la base de la reproductibilité des résultats au sein d’un test et entre plusieurs tests. Cette caractéristique est extrêmement importante pour s’assurer que les résultats obtenus au cours d’une étude sont fiables et reproductibles d’une expérience à l’autre.

La précision est mesurée sous la forme d’un coefficient de variation (CV) exprimé en % à partir de la valeur moyenne.

Deux types de précision sont à considérer, la précision intra-essai et la précision inter-essai :
- La 1ère représente la reproductibilité entre les puits d’une même plaque. Cela permet à l’expérimentateur de faire plusieurs « réplicats » d’un même échantillon dans différents puits d’une même plaque et d’obtenir des résultats similaires.
- La seconde correspond à la reproductibilité entre plusieurs essais. Elle garantit que les résultats observés seront reproductibles quand plusieurs kits/plaques sont utilisés au fil du temps.

Un % de CV inter-essai inférieur ou égal à 15 % est généralement acceptable. Le % de CV intra-essai doit être quant à lui inférieur ou égal à 10 %.
Exemple avec le kit Human IL-8
Intra-Assay : CV < 8 %
Inter-Assay : CV < 10 %
C. Linéarité et « Spike-Recovery »

Ces 2 données sont représentatives de la précision du test et permettent de voir si un élément dans l’échantillon peut interférer avec le dosage.

- Linéarité de la dilution : elle est corrélée à la précision de l’ELISA et à sa compatibilité avec l’échantillon analysé. Elle identifie quelle concentration de l’échantillon biologique est compatible avec le test et aussi la gamme linéaire du test pour cet échantillon c'est-à-dire la gamme dans laquelle le signal détecté est directement proportionnel à la concentration de l’analyte mesuré.
Elle est déterminée en supplémentant l’échantillon avec une concentration connue d’une protéine cible recombinante (contrôle positif pour l’ELISA), puis en réalisant des dilutions en série. Le test ELISA permet ensuite de déterminer la concentration de la protéine en se référant à la courbe standard. La linéarité est définie par rapport à la quantité d’analyte calculée sur la base de la courbe standard. La concentration calculée finale de l’analyte dans un échantillon doit être la même pour n’importe quelle dilution présente dans la gamme dynamique du test.  
La linéarité est donnée sous la forme d’un %. Elle est considérée comme faible si elle est inférieure à 80 % ou supérieure à 120 % et cela signifie que les diluants de l’échantillon (et/ou du standard) ou l’échantillon lui-même interfèrent avec la détection de l’analyte. La linéarité est importante pour une mesure précise de la concentration en analyte sur l’ensemble de la gamme dynamique de l'essai.

- Spike-Recovery : cette donnée détermine si la détection de l’analyte est affectée par la composition des échantillons.
A titre d’exemple, des échantillons comme du sérum ou du plasma peuvent contenir des facteurs (type EDTA, héparine) qui empêchent une quantification précise de l’analyte en interférant au niveau de la liaison antigène-anticorps. Au niveau du dosage, cela se traduit par un signal plus ou moins fort.

Comment cette donnée est-elle déterminée ? Des quantités connues de l’analyte sont ajoutées dans différents types d’échantillons (sérum, plasma avec de l’EDTA, plasma avec de l’héparine, …). Le test ELISA est réalisé et la concentration de l’analyte est déterminée grâce à la courbe standard réalisée en parallèle. Le spike-recovery correspond à la différence entre la concentration observée et celle attendue. Il est représenté sous forme d’un % qui doit être compris entre 80 et 120 % pour qu’un kit soit fiable et adapté à la quantification de son analyte d’intérêt.

Exemples de Spike-Recovery et de Linéarité avec le kit Human IL-10
Spike-Recovery et Linéarité avec le kit Human IL-10
Spike-Recovery et Linéarité avec le kit Human IL-10
QUESTIONS FRÉQUEMMENT POSÉES
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A. Pour faire mon ELISA, est-il possible de mélanger les composants provenant de différents fournisseurs ?
Non, ce n’est pas recommandé car les performances du test ELISA seront affectées. Les anticorps diffèrent entre les fournisseurs de par leur spécificité et c’est cette même spécificité qui va dicter comment le signal sera détecté en ELISA. Les standards fournis par les différents fournisseurs peuvent aussi être différents. En effet, il s’agit de protéines recombinantes exprimées et purifiées selon des méthodes différentes selon les fournisseurs et peuvent présenter une immunoréactivité variable selon les lots.
 
B. Est-il possible de faire un ELISA avec des échantillons de tissus ?
Les ELISA sont compatibles avec des homogénats/extraits de tissus/cellules si ces derniers respectent les critères ci-dessous :
- Sont issus d’une lyse ou d’une homogénéisation réalisée dans un tampon de pH neutre qui ne contient aucun agent chimique dénaturant comme de l’urée, thiourée ou SDS
- Sont exempts ou présentent un taux minimum de détergents (SDS, Triton X-100, …) dans les tampons utilisés
- Ne présentent aucune force ionique excessive (concentration de sel supérieure à la force ionique physiologique).
Les tampons doivent contenir des inhibiteurs de protéases en quantité suffisante pour préserver les protéines cibles de toute dégradation protéolytique par les enzymes libérées des cellules.
 
C. A quelles étapes peut-on stopper son test ELISA en cours ?
Les plaques peuvent être coatées avec l’anticorps de capture toute la nuit à 4°C et ensuite être stockées à 4°C pendant 1 à 2 jours supplémentaires.
Quant à l’étape de blocage, les plaques peuvent être conservées avec le tampon de blocage toute la nuit ou 1 à 2 jours à condition d’être scellées à l’aide d’un film protecteur. De manière générale, les plaques ne doivent jamais sécher. Il convient de noter qu’un stockage prolongé des plaques après « coating » avec l’anticorps de capture avant leur utilisation peut éventuellement conduire à une augmentation du signal issu du bruit de fond.
LE SAVIEZ-VOUS ?
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A. Pourquoi l’utilisation d’azide dans les tampons n’est-elle pas recommandée ? 
Car, l’azide est un inhibiteur irréversible de l’HRP.

B. Les concentrations recommandées pour les anticorps coatés au fond des plaques et de détection
Concentrations recommandées pour les anticorps coatés et détection